摘 要

：本文采用L₁₆(4⁵)正交试验设计及单因素优化实验，建立了适合银杏SRAP分析的最佳PCR反应体系：该体系中含dNTP 0.15 mmol.L^-1、引物各0.2µmol.L^-1、Mg² 1.5 mmol.L^-1、Taq酶1.25U 、DNA 20ng。最后以6个银杏品种DNA为模板对所优化的体系进行SRAP-PCR扩增反应，获得了清晰的扩增谱带。表明优化确立的SRAP-PCR反应体系稳定可靠,可用于银杏SRAP标记的相关分析。

关键词： 银杏；SRAP分子标记；体系建立与优化

Establishment and optimization of SRAP-PCR system of Ginkgo

Abstract: In this paper, L₁₆ (4⁵) orthogonal design and optimization of single factor experiment was used to establish a suitable SRAP- PCR analysis system of Ginkgo biloba. This system contained dNTP 0.15 mmol.L^-1, each primers 0.2 µmol.L^-1, Mg² 1.5 mmol.L^-1, Taq enzyme 1.25U and DNA 20ng. Finally, six ginkgo varieties were used to check this optimized system for SRAP-PCR amplification reaction, As a result, the clear amplified dands were acquired. so it indicated that the optimized SRAP-PCR reaction system is stable and reliable. It can be used for correlated analysis of ginkgo.SRAP markers.

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Key words: Ginkgo biloba；SRAP makers；PCR System established and optimized

目 录

前 言 3

1 文献综述 4

1.1 DNA分子标记技术的特点 4

1.1.1 操作性强 4

1.1.2 变异性高 4

1.1.3 信息量大 4

1.1.4 遗传稳定 4

1.2 DNA分子标记技术的分类 5

1.2.1 以 DNA 杂交为基础的分子标记 5

1.2.2 以 PCR 为基础的分子标记 5

1.2.2.1 随机扩增多态性 DNA 5

1.2.2.2 扩增片段长度多态性 6

1.2.2.3 序列标志位点） 6

1.2.2.4 序列特异性扩增区域 7

1.2.2.5 酶切扩增多态性序列 7

1.2.2.6 简单序列重复 7

1.2.2.7 简单序列重复区间扩增多态性 7

1.2.3 以 DNA 芯片技术为基础的 DNA 标记 8

1.3 SRAP 标记详细介绍 8

1.3.1 SRAP 标记的原理 8

1.3.2 SRAP标记引物设计与应用 9

1.3.3 SRAP标记的特点 9

1.3.4 SRAP的功能 10

1.4 分子标记在银杏中的利用 10

2 材料与方法 11

2.1植物材料 11

2.2 实验试剂 11

2.2.1主要生化试剂包括： 11

2.2.2 SRAP引物 11

2.3实验所需设备 12

2.4 实验方法 12

2.4.1 DNA的提取 12

2.4.2 DNA浓度与质量检测 12

2.4.3 SRAP-PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 12

2.4.4 SRAP-PCR反应体系建立 12

2.4.5 SRAP-PCR反应体系优化 13

3 结果与分析 13

3.1 DNA电泳检测 13

3.2 SRAP-PCR反应体系的建立 14

3.3 SRAP-PCR反应体系优化 14

3.3.1 Taq DNA聚合酶优化 14

3.3.2 dNTP浓度的优化 14

3.3.3 Mg² 浓度的优化 15

3.3.4 引物浓度的优化 15

3.3.5模板DNA用量的优化 16

3.3.6银杏优化后的SRAP-PCR反应体系的验证 16

4. 结论 17

参考文献： 18

前 言

银杏药理作用突出，经济价值极高，适应能力强，是一种原产我国的重要经济树种，

同时也是世界上最古老的树种之一，生命周期长,并长期通过无性方式进行繁殖,具有很高的研究价值。国外很多学者就银杏遗传基础方面的问题进行了大量的研究。由于不同地域间的相互引种,使得同名异物和同物异名现象十分普遍。如何准确地对现有银杏品种进行鉴定和分类,是进一步科学有效地利用银杏资源的基础。过去人们对品种的分类和鉴定主要采用比较植物学特征并结合细胞学、胞粉学和酶学等方法,但存在一定的局限性，对关系较近的材料不能准确区分。经过多年来全球的科学工作者的研究，人们对银杏的了解越来越深，更促进了银杏在生物学、医药学、生态学等各个研究领域中的应用。近10多年来发展起来的DNA分子标记技术为品种鉴定与分类开辟了广阔的空间。它是在DNA水平上对遗传多态性的直接放映，不受表现型和环境的影响。SRAP是2001年由Li和Ouiros提出的一种新型的基于PCR的分子标记技术，与其他分子标记技术相比，具有明显的优越性，如简便、稳定、中等产率、高共显性、易于测序等，近年来主要被应用在植物遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建及基因定位等诸多领域。目前SRAP技术在银杏研究中的应用尚未见报道。因此，本研究试图通过试验建立并优化适合银杏研究的SRAP反应体系，为进一步深入研究银杏品种的遗传多样性及亲缘关系提供技术支撑。

1 文献综述