摘 要

青钱柳是我国特有的单种属濒危植物,是国家重点保护的植物之一。本研究旨在使用9个ISSR引物和6个SSR引物探讨青钱柳天然居群遗传多样性和遗传结构，这两种分子标识都能很好地应用于青钱柳的遗传多样性评价。使用ISSR和SSR分析29个青钱柳天然居群结分别得到120条和24条多态性条带，根据分子方差剖析结果青钱柳的遗传多样性主要来自于种内。基于ISSR和SSR分子标记的聚类分析都得到4次要集群。遗传结构分析结果表明，29个种群间存在较高的遗传分化。通过ISSR和SSR的分析结果得出，青钱柳样本的地理分布受山脉影响，其中武夷山和秦岭山脉对于青钱柳的居群划分有显著影响。我们认为青钱柳地理起源来自多个起源中心，保护四川省（GQ19，M20）和武夷山（PK11，SM12）群体的多样性，对于青钱柳天然居群的遗传多样性具有重大意义。

关键词：青钱柳；ISSR；SSR；遗传多样性；遗传结构

Moleculargeneticvariationandstructureof

Cyclocaryapaliurus

Abstract

Grown for its fine timber and a medical,Cyclocaryapaliuruss isnative to China and its the sole spices in itsgenus. Inthisstudy，thecurrentstudyaimed toinvestigategeneticvariationandstructureusing9inter-simplesequencerepeat(ISSR)primersand6simplesequencerepeat(SSR)primerpairs.DNAanalysisof29CyclocaryapaliurusspopulationusingtheISSRandSSRmarkersresultedinproducingatotalof120and24polymorphicbands,respectively.TheISSR-andSSR-basedclusteranalysesbothgeneratedfourclusters.ThroughtheISSRbasedandSSRbasedresultsthatthegeographicaldistributionsoftheCyclocaryapaliurusssampleswasaffectedtomountainrange.ThegeneticvariationsofCyclocaryapaliurusswerefoundtobematching,twokindsofmolecularmarkersshowedgoodperformanceinthisspecies.Protectionofsichuanprovince(GQ19、M20)andPK11、SM12(WuyiMountains)

canbeagoodwaytoprotectthegeneticdiversityofCyclocaryapaliurus.

Key word: Cyclocarya paliurus; molecular marker; ISSR SSR ;genetic diversity

目 录

1 前言 1

1.1 青钱柳研究现状 1

1.1.1 青钱柳的生物特性 1

1.1.2 青钱柳的开发利用价值 2

1.1.3 国内外研究概况 2

1.2 遗传多样性 3

1.2.1 遗传多样性的检测方法 3

1.2.1.1 形态学标记 3

1.2.1.2 细胞学标记 4

1.2.1.3 生化标记 4

1.2.1.4 分子标记 5

1.2.1.4.1 SSR标记的特点和原理 5

1.2.1.4.2 ISSR标记的原理和特点 6

2 材料与方法..........................................................................................................................8

2.1 采样地点 8

2.2 DNA提取 10

2.3 SSR扩增 10

2.4 ISSR扩增 10

2.5 数据采集 13

3 结果与分析........................................................................................................................15

3.1 ISSR和SSR的多态性 15

3.2 基于ISSR和SSR标记的遗传多样性结果 15

3.2.1 基于ISSR分子标记的结果 15

3.2.2 基于SSR分子标记的结果 17

3.3 基于ISSR和SSR标记的聚类和种群结构分析 19

4 结论....................................................................................................................................23

致谢......................................................................................................................................... 25

参考文献： 26

1前言

1.1青钱柳研究现状

青钱柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja],人们又叫它摇钱树、麻柳、青钱李等俗名，属于胡桃科(Juglandaceae)的青钱柳属植物^[1]。青钱柳是落叶乔木，树的高度大概在10到30米；树皮的颜色灰色；枝条的颜色黑褐色，在4到5月开花，叶子质感是革质，单数羽状复叶。裸芽被褐色腺鳞，叶轴被白色弯曲毛及褐色腺鳞；小叶对生或稀近对生长，椭圆形至长椭圆状披针形，长3-4cm，先端渐尖，基部偏斜，细锯齿，两面均被腺鳞^[2]。果仁扁球形，圆盘翅径2.5 - 6厘米尖端具旅馆存在花柱及花被片。叶表皮分离等方法利用靑金柳叶片的形态结构研究表明：靑金柳叶表皮，许多小乳突腺毛，盾鱼鳞状和非腺毛表毛皮，气孔器不规则型只是表面分布，表皮的叶肉组织中有规律的分布在内的班明星晶的细胞；主脉中维環状管组织，关闭副维管束；二级的脉叶内的分店，相互连接形成脉环，三级脉和顶型，脉之间的分歧区内的自由结束的小细脉^[3]。
1.1.1青钱柳的生物特性

青钱柳通常在暖和潮湿肥沃、排水良好的酸性红壤，黄红壤上面生长，喜好生长在湿度较大的环境中。调查结果显示，在土壤缺水营养不充足的的地方，青钱柳长势不好。青钱柳有欣赏、药用和材用价值等很多功能，有很大的保护价值和使用木材，观赏树形的功能。但是，目前的青钱柳资源大部分是天然树林，星星点点的分布在一些人迹罕至深山老林和一些自然保护区中，到目前为止，国内外还没有成功的大量繁殖和栽培出青钱柳，丰富青钱柳的资源，因为资源限制，降低了青钱柳的开发利用和产业化进度。青钱柳资源至今还不能普及。 青钱柳是胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属的植物，是只有我国才有的单种属植物^[4]。它的叶片含有很多种对人体有益的有机和无机成分，能够让降血糖,、降低血压血脂、抗癌、等药理保健价值^[5]。在江西、浙江、江苏、安徽、福建、台湾、湖北、四川和贵州等省均有青钱柳的分布，地理种源间分化明显，但目前对青钱柳种质资源的亲缘关系及遗传多样性的研究还不多，这次研究对收集种质资源有重要意义同时也有利于人们保护和利用青钱柳的资源^[6]。
1.1.2青钱柳的开发利用价值
青钱柳用途很广泛，集入药、保健、木材用、欣赏等多种功用于一体^[7]。它的潜在的开发利用价值不可估测，价值很高，查阅《中国中药志要》记载内容可以知道，青钱柳的树皮树叶可以清楚体内火气，化解体内的毒气、消除肿胀，同时还有止痛药的功能,古代贫苦人家也可用它治疗顽癣^[8]，很长一段时间里民间都采摘青钱柳的叶片泡茶喝^[9]。许多科学研究证明，青钱柳同时还有延缓衰老等多种功能，是非常好的纯天然保健食品资源^[10]，可以提高人体的抵抗疾病的能力。青钱柳的木材纹理笔直^[11]，木材的构造有点细，重量和硬度都比较合适，所以进行木材的切削比较容易，并且切面平滑美观。木材里面水分蒸发快^[12]，木材适合做家具、工具、胶合板、建筑及薪炭材等。青钱柳的树姿青秀，果实的样子像古代的铜板，可以用作良好的绿化树种。
1.1.3国内外研究概况
青钱柳仅在我国部分地区有种质资源，分布在江西、浙江、江苏、安徽、福建、台湾、湖北、湖南、四川、贵州、广西、广东和云南等地。但是目前的青钱柳资源都零散的分布在许多地方，没有集中的资源分布区，多数分布在人迹罕至的深山老林中，一些自然保护区中也会有青钱柳资源，分布情势的严峻让青钱柳的开发利用变得很困难。最近几年，分子技术快速发展，分子标记技术大量应用在植物遗传育种研究中，其不受植物生长发育和环境条件的制约，能够准确可靠地提供鉴定信息，并且种类较多，例如RFLP、RAPD、SRAP、SSR、ISSR和SCAR等许多鉴定方法。在植物遗传育种中，分子标记主要用于基因组图谱构建、基因定位、辅助标记选择、种质资源评价、基因克隆、杂种优势预测、杂交育种及跟踪育种过程等方面。本试验旨在建立青钱柳ISSR扩增体系，并通过ISSR标记初步评价所收集的青钱柳。以一年生青钱柳叶片为试验材料，建立青钱柳ISSR扩增体系，并通过ISSR标记初步评价所收集的青钱柳种质资源的亲缘关系和遗传多样性，丰富理论基础，促进青钱柳进一步的发展。