摘 要

：抗生素抗性菌及抗生素抗性基因扩散是当前环境领域的一个热点问题。由于近年来在畜禽养殖中对抗生素的种类和数量的使用迅速增长而造成了养殖过程中抗生素的滥用，使得大部分的抗生素以原形或其代谢物的方式从粪便出排除，从而导致了畜禽的粪便中的抗生素含量较高。这种抗生素含量较高的畜禽粪便一般多用于农田中，诱导出了大量的抗生素抗性基因（ARGs），对农田的土壤造成了抗生素抗性污染。本研究是以前期分离自不同肥料处理的抗生素抗性菌为对象，以长期施用化肥的土壤为对照，通过常规PCR技术，分析不同来源的抗生素抗性菌的抗性基因的主要类型，确定不同施肥处理对抗性菌的抗性基因种类的影响。探讨粪肥农用与土壤细菌多重抗性发生的相关性，从而为粪肥农用的生态风险评估与控制提供实验数据。

关键字：抗生素抗性菌，聚合酶链反应（PCR），粪肥农用，抗生素抗性基因

Effect of farm manure on antibiotic resistant

resistance gene spectrum

Abstract: The spread of antibiotic resistant bacteria and antibiotic resistance gene is a hot issue in the current environment.In recent years,the rapid increase in the number and variety of antibioticsIn livestock and poultry breeding caused the abuse of antibiotics in the course of breeding.So most of the antibiotics are eliminated in the form of a prototype or a metabolite from feces,which led to higher levels of antibiotics in the feces of livestock and poultry.The higher antibiotic content of livestock and poultry manure is generally used in farmland,a large number of antibiotic resistance genes(ARGs) were induced.It caused the antibiotic resistance pollution to the soil of farmland.This study was based on the early stage of antibiotic resistant bacteria isolated from different fertilizer treatments,with the long-term application of chemical fertilizer of soil as check.By PCR,the main types of resistance genes of different sources of antibiotic resistant bacteria were analyzed,and determine the effects of different fertilization treatments on the kind of resistance genes of the resistant bacteria.To investigate the correlation between the occurrence of farm manure and soil bacterial resistance,in order to agricultural ecological risk assessment and provide experimental data for control of manure.

Keywords: Antibiotic resistant bacteria,Polymerase chain reaction(PCR),

Farm manure,Antibiotic resistance gene

目 录

1 前言

1.1研究背景

1.2 畜禽养殖中的抗生素

1.3 抗生素抗性基因（ARGs）

1.3.1环境中ARGs的来源和种类

1.3.2 ARGs在环境中的传播与扩散

1.4 PCR技术

1.5 研究的目的与意义

1.6 研究内容

2 材料与方法

2.1药品试剂

2.2 仪器设备

2.3 样品的采集

2.4 PCR前的准备

2.5 普通PCR反应程序

2.5.1 引物及其PCR扩增条件

2.5.2 PCR反应程序

2.6 数据处理方法

3结果及分析

3.1 ARGs的定性检测结果

3.1.1 电泳图

3.1.2 电泳图结果汇总

3.2 结果分析及讨论

3.2.1 沿江潮土抗性菌抗性基因PCR结果分析

3.2.2 沿海潮土抗性菌抗性基因PCR结果分析

3.2.3 分析及讨论

4结论

致 谢

参考文献

1 前言

1.1研究背景

抗生素是上个世纪最重要的医学发现之一，是能够控制人类感染性疾病的一种药物。目前，除了用于人类医疗外，抗生素还作为促生长剂、疾病治疗或预防剂用于畜禽养殖业以及渔业^[1]。据报道，每年约2400万吨的抗生素用于动物饲养业，而这其中70%以亚治疗剂量添加到饲料中用来促进畜牧生长，只有300万吨的抗生素用于人用医疗^[11]。近年来，由于滥用抗生素而导致大量耐药性致病菌的出现，引起了人们对抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）的广泛关注。抗生素抗性基因是“超级细菌”产生的根源，并且能持久性的残留在环境中，与抗生素本身的环境危害相比，在不同环境介质中的传播、扩散的危害可能更大^[2]。近年来由于抗生素在养殖业和畜牧业中的大量滥用，在养殖动物肠道内能诱导出大量抗性菌株，而这些抗性菌株随粪便排泄后经过自然界中多种循环途径进入到水源、土壤、大气等中。自然水体和陆地环境也许会充当ARGs的储存库，而其中的ARGs通过水体或食物链转移到相关病原菌群体中，将会促进抗生素抗性的扩散并对人类健康构成威胁^[12]，已成为当前国际上的研究热点之一。为了防止我们的环境继续遭受着抗生素抗性基因的危害，应该加强对抗生素抗性基因的研究，并找出及解决这一问题的途径。

1.2 畜禽养殖中的抗生素

抗生素是一类可以治疗各种细菌感染或者抑制致病微生物的药物，被广泛的用于畜牧动物疾病的防治、农业生产等领域。在20世纪60年代，西方国家就发现并将抗生素添加到饲料中喂猪，会促进猪的生长，因而抗生素便开始作为饲料添加剂使用。根据美国疾病预防控制中心（CDC）的资料，美国有17 大类抗生素促生长剂在被使用，几乎包括了治疗人类感染的全部抗生素种类；每年用于农业畜牧业的抗生素有18000吨，其中有12600吨用于非治疗用^[3]。而据估计，我国每年抗生素原料生产量约为21万吨（化学工业学会和制药工业学会2005年统计数据），其中有9.7万吨的抗生素用于畜牧养殖业，在家禽生产中，抗生素90%都被用为饲料添加剂^[4]。人畜服用的抗生素类药物大部分不能被身体充分吸收利用，动物饲料中添加的抗生素大约有30% ~ 90%以母体药物或代谢产物的形式随粪尿排出体外^[5]，进入到水和土壤等环境中，造成污染。针对这种现象，各个国家也开始提出了限制或禁止使用含有抗生素的饲料喂养动物，但是仍旧存在使用的情况。国家食品药品监督管理局细菌耐药性监测中心在2007年对国内5个省市进行的畜牧养殖业滥用抗生素进行现场调查。结果显示，饲养场抗生素滥用现象非常严重，且主要是添加在饮用水中使用，而这种给药方式早已被证明是最容易导致细菌产生耐药性的^[3]。

大量的抗生素随着动物粪便被排除后，抗生素及其代谢产物通过粪肥施用被带入农田生态系统，是其进入土壤环境的一个重要途径。抗生素在土壤环境中能保持很长时间的活性，可通过淋溶、渗滤等迁移途径污染地表水、地下水和饮用水源^[6]，并可通过食物吸收和积累进入食物链，对动物和人体健康构成潜在危害，影响陆生和水生的生物的生命活动。