摘 要

本文研究了以银杏叶与杜仲叶为原料复配培养基，用酵母菌、黑曲霉菌复合菌固态发酵过程中，以主要营养成份、活性物质含量以总黄酮和绿原酸含量的变化为参考值，进行了单因素试验和正交试验。实验结果表明，最佳工艺参数为：初始含水量60%，培养基初始pH 5.0，接种量酵母菌为1%，银杏叶与杜仲叶配比为2：1，黑曲霉菌为2%，培养温度为28℃，培养时间为96h，培养基通过生物转化后营养丰富，总黄酮和绿原酸含量达到最优化，分别为2.124%和0.421%，产品风味和适口性有了较大改善。

关键词：银杏—杜仲叶；中药添加剂；固态发酵

Study On the Condition of Solid State Fermentation of Chinese Herbal Medicine Composited by Ginkgo-eucommia Leaves

Abstract

This study optimized the production of total flavonoids and chlorogenic from ginkgo leaves and eucommialeaves by yeast andAspergillus niger with solid-state fermentation. The experimental results showed that the optimal parameters was 60% of moisture content, pH 5, 1% of yeast and 2% of Aspergillus inoculation amount, the ratio of Ginkgo leaf and Gucommia leaf was 2:1, 28^oC, culturing for 92h. The optimum flavonoids and chlorogenic was up to 2.124% and 0.421% respectively. The flavor and palatability has greatly improved.

Keywords:Ginkgo - eucommia leaves; Chinese herbal medicine; Solid state fermentation

目 录

前 言 1

1 文献综述 1

1.1 立题背景及意义 1

1.2微生物发酵中草药的原理 2

1.3 微生物发酵中草药的特点 3

1.3.1 提高疗效，增加用途 3

1.3.2 不易产生耐药性 4

1.3.3 降低毒性 4

1.3.4 节约药源 4

1.4 固态发酵技术 5

1.4.1 现代固态发酵技术的特性 5

1.4.2现代固态发酵技术常用的菌种和基质 6

1.4.3 现代固态发酵多菌种发酵技术 7

1.4.4固态发酵基质原料特征 7

1.4.5固态发酵工艺条件 8

2材料与方法 9

2.1材料与仪器 9

2.1.1试验原料 9

2.1.2培养基 9

2.1.3仪器 9

2.2实验方法 10

2.2.1试验流程 10

2.2.2 发酵工艺条件 10

2.2.3 总黄酮、绿原酸的提取 10

2.2.4 总黄酮含量的测定 11

2.2.4.1芦丁对照品溶液制备 11

2.2.4.2可见光度法扫描及标准曲线的绘制 11

2.2.5 绿原酸含量的测定 11

2.2.5.1绿原酸对照品溶液的制备 11

2.2.5.2可见光度法扫描及标准曲线的绘制 11

2.2.6 总黄酮、绿原酸的含量测算 12

3实验结果 12

3.1单因素试验 12

3.1.1银杏与杜仲叶配比对总黄酮和绿原酸含量的影响 12

3.1.2黑曲霉菌接种量对总黄酮和绿原酸含量的影响 13

3.1.3培养温度对总黄酮和绿原酸含量的影响 14

3.1.4培养时间对总黄酮和绿原酸含量的影响 15

3.2 正交试验 16

4结果与讨论 18

致谢 19

参考文献 19

前 言

现代人们对食品安全的高度重视，对肉产品品质要求不断提高, 防病促生长的激素及抗生素等易产生抗药性和药物残留的饲料添加剂将逐步受到限制甚至被陶汰^[1]。在保证对饲料中的添加剂和抗生素符合国家规定的基础上，天然的中草药饲料添加剂逐渐体现出了自己的优势。银杏和杜仲均为传统的中药，它们除具有一般树叶的营养外，还富含黄酮类化合物、萜内酯、绿原酸、聚戊烯醇等对人和畜禽具有显著生物活性的化合物。这些活性物质能抑制鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏杆、大肠杆菌等多种病原微生物；可以有效增强动物机体的免疫功能，促进机体免疫器官的发育；并具有提高动物的繁殖能力和生长性能等作用^[2]。近年来的研究表明了以银杏叶、杜仲叶及其提取物作为家禽、家畜水产品的饲料添加剂，不仅能减少预防用药，增加了食用安全性^[3]，预防动物疾病的发生，调节动物免疫功能^[4-5]，还能提高食用品质，增强口感^[6]

经过发酵后的银杏叶饲料添加剂营养价值及生物活性都有了较大幅度的提高^[7]，而且银杏生物饲料添加剂对肉仔鸡增重、肉品质均有更加明显的促进和改善作用^[8]。

本文通过研究固态发酵工艺，考察银杏-杜仲叶复合中草药发酵生物饲料添加剂的营养成份指标变化，为复合中草药的固态发酵生物饲料添加剂的进一步应用奠定基础。

1 文献综述

1.1 立题背景及意义

银杏(Ginkgo biloba)，又名白果、鸭脚等，是我国古老树种，具有较高药用价值^[9]。银杏叶具有味甘、苦、涩，性平，归心、肺经，具有敛肺，平喘，活血化瘀，止痛的功效，主用于肺虚喘咳，冠心病，心绞痛，高血脂症的治疗。银杏叶中主要的化学成分有萜内酯、黄酮、聚异戊烯醇、酚酸等，其中黄酮和萜内酯类成分具有很强的药理活性^[10]。

杜仲 (EucommiaulmoidesOliv )是中国特有的名贵经济树种，落叶乔木。20世纪50年代以来，国内外学者已从杜仲皮、叶、花和果实中提取获得化学成分多达 134种^[11]。按其结构分为木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类、苯丙素类、甾醇类及三萜类、多糖类、抗真菌蛋白和矿物元素等^[12]。杜仲具有降压作用、降血脂作用、降血糖作用、抗肿瘤作用、抗菌抗病毒作用、抗炎、抗氧化作用、保肝护肾、抗骨质疏松作用，另外还有抗心血管重塑、神经保护、免疫调节、镇静催眠、增加胃液和胆汁的分泌、松弛子宫平滑肌和改善勃起功能^[13-14]。而且杜仲叶具有与杜仲皮同等的功能成份。杜仲叶具有补肝肾、强筋骨等功能，用于治疗肝肾不足、头晕目眩、腰膝酸痛、筋骨痿软等症^[15]。现代药理研究表明杜仲叶具有抗高血压、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗肥胖、改善骨质代谢及增强免疫功能等作用^[16]。

同时，继瘦肉精、三聚氰胺、抗生素等食品安全问题被暴露之后，国内外对食品安全问题越发重视。一些饲料所含的添加剂虽能起到增加家禽、家畜产量和抗病的目的，也导致了家禽、家畜产品产生有害物质，造成对人身体的危害。在保证对饲料中的添加剂和抗生素符合国家规定的基础上，天然的中草药饲料添加剂逐渐体现出了自己的优势。国内外的最新研究表明，将两种或两种以上的中药按一定的比例复合发酵获得的添加剂添加到饲料中，可以明显地提高畜禽的促生长作用和防病抗病作用^[17]。

1.2微生物发酵中草药的原理

中草药富含多种化学成分，如：蛋白质、氨基酸、维生素、各种微量元素、有机酸类、酶、生物碱、多糖、甙类、鞣质等多种起营养作用和促生长作用的活性物质。但由于其植物细胞壁的阻碍作用，它的大量有效成分难以释放出来，导致其药效慢，使用剂量大。目前，科研工作者开始研究发酵中草药来提高其药效。微生物在发酵中草药的过程中能产生大量消化酶，利用微生物发酵的特性来提高药效的方法为中草药的开发提供了新的思路。中草药的某些成分可能对微生物的生长和代谢有促进或抑制作用，从而改变微生物的代谢途径，进而形成新的成分。而中草药通过微生物的发酵，可能将中草药中的有毒物质进行分解，从而降低中草药的毒副作用，也可能通过微生物的发酵，将原来不易消化吸收的大分子物质分解成小分子物质，利于肠粘膜的吸收，使血液中的有效成分迅速达到有效浓度。因此，微生物发酵中草药不仅能使中草药中的有效成分最大限度地释放，增强其原有性能，还能利用微生物发酵过程中产生的代谢产物促进动物生长，提高生产力。

1.3 微生物发酵中草药的特点

1.3.1 提高疗效，增加用途

中草药经过微生物的发酵，其中的有效活性物质被最大限度地释放，其中不能被动物机体直接利用的有效活性组分因在体外被微生物分解而变得可被直接利用，从而能更好地发挥作用。有研究表明，中草药有效成分大多是微生物的次生代谢产物，这些代谢产物可将动物机体不能直接利用的中药有效活性组分，在体外降解为分子量较小的小分子活性物质。这些小分子活性物质更易于通过动物的血脑屏障与体细胞蛋白结合，使得中草药的有效成分在动物体中吸收更快、更完全，治疗范围更广。微生物在生长过程中主要消耗动植物的蛋白质、糖等常规物质，可能对中草药的有效成分有浓缩作用，从而大大提高了中草药活性成分的含量。有研究报道，发酵的黄芪所含的黄芪多糖是普通煎、煮、熬水提法的 0.365-5.040倍。我国卫生部药品检验所动物试验结果显示，发酵中草药只需1/28 的量，即可与一般煎、煮、熬水提物一份的量发挥同等的药效。有学者报道了黄芪发酵液的功效比非发酵液有明显提高，发酵黄芪用药 7d 可明显促进正常小鼠 T、B 淋巴细胞的增殖。20 世纪 90 年代，庄毅等（2004）提出了药用真菌新型固体发酵工程^[18]。即以药用真菌为菌种发酵中草药，使药用真菌与中草药的研究有机结合起来。经过药用真菌的生物转化，对中草药有增效、解毒、改变药性的作用。庄毅等还用槐耳真菌发酵黄芪研究发现：从槐芪菌质与槐耳菌质及未经发酵的纯黄芪药材中提取多糖，进行IFN诱生比较，槐芪菌质的多糖药效明显超过槐耳菌质、纯黄芪中提取多糖的药效。槐芪清膏经药理实验充分证实了槐芪清膏促进机体免疫功能的作用比槐耳清膏更强，尤其以促进诱生动物血清干扰素的作用最明显，而且槐芪清膏比槐耳清膏有显著增强抗鸭肝炎病毒的能力和良好的保肝作用，并保持了对动物体内移植肿瘤S180一定的抑瘤能力，从而证明了微生物发酵中草药所产生的增效作用。

1.3.2 不易产生耐药性

经过微生物发酵的中草药，能通过对动物机体的整体调节和激发机体一切抗菌的积极因素，即非特异性免疫抗菌因子，可在动物机体内全方位杀灭病原菌。而这种抗菌机制不直接作用于菌体，因而不会使微生物产生抗药性。

1.3.3 降低毒性

传统的中草药炮制法可将带有毒性的生药转化为毒性较弱、可内服的安全用药。这可能是因为微生物、生物的分解作用将中草药中的有毒物质进行了分解或是合成了新的成分，从而降低中草药物的毒副作用。例如4 mg的乌头碱可导致人死亡，但在中医临床中，使用其炮制品可使用药量达到1.5-3.0g，不仅可以外用，而且可以内服。研究发现，乌头碱经过炮制后水解为乌头次碱和乌头原碱，它们的毒性分别降低至乌头碱的1/200和1/2000，安全范围得到了扩大，而镇痛效果却没有降低，使临床应用的安全性得到了保证^[19]。

1.3.4 节约药源

通常情况下，中草药在提取有效成分后其废渣被丢弃。这不仅对环境造成污染，也浪费了宝贵的中草药资源，而利用微生物发酵中草药药渣可以很好地解决这一难题。目前已有研究者利用中草药药渣培养食用菌、发酵制肥料、造纸、生产蛋白饲料等。利用香菇发酵中草药废渣，可将药渣中的纤维素、木质素等大分子物质降解，将中草药废渣转化为菌体蛋白和香菇多糖，具有较高的营养价值，并可增强机体的免疫功能。王建芳等（2007）利用香菇对中草药废渣进行了固态发酵和液态发酵。研究表明，无论是液态发酵还是固态发酵，都能提高粗蛋白和可溶性多糖的含量，降低纤维素的含量，使中草药废渣的营养价值大大提高。3.5 修饰活性成分的结构，产生新的活性物质^[20]。