摘 要

辣椒根腐病严重影响辣椒的产量和品质。设施栽培重茬，高温高湿环境给辣椒根腐病菌提供了有利的生长、繁殖条件，影响辣椒质量，带来严重的经济损失。本研究从高山草甸、沼泽、海底泥沙以及江苏省苏北种植辣椒、梨树、杏树等地的根际土壤中分离、筛选对辣椒根腐病有防治效果的拮抗细菌，同时测定了拮抗菌株的促生作用和盆栽防效，并进行了拮抗菌的种属鉴定。研究结果表明，经过初筛共获得21株对根腐病菌孢子萌发具有较好效果的拮抗菌株，经过复筛最终确定对根腐病菌孢子和菌丝都具有抑制作用的菌株11株；进一步对11株菌株进行了盆栽辣椒根腐病防效实验，结果表明，菌株XH2，XH3，XH5，XG3和shuisha1的防效为65%以上，最高可达77.32%。对这11株拮抗细菌进一步的平板定殖和促生实验显示，11株菌对辣椒均具有促生作用，且都可在辣椒根系周围生长。综合16s rRNA和gyrB部分序列进行种属鉴定，结果显示，分离的11株菌株中1株是假单胞菌属，其余10株都是枯草芽孢杆菌，这些拮抗菌株的获得，不仅丰富了我们的菌株资源库，更为防治辣椒根腐病生物农药的创制奠定了基础。

关键词：辣椒根腐病；拮抗细菌；鉴定；定殖；防效

Isolation, Screening and Identification of the antagonistic Bacteria for the control of pepper root rot caused by Fusarium solani

ABSTRACT

In this study, 41 soil samples from several plant rhizosphere were isolated. 21 strains had capacity of inhibition of spore germination were obtained by primary screening. Then, eleven strains owned inhibition of spore germination and Mycelium growth were identified by re-screening. The evaluation of biocontrol efficiency of 11 strains on the pepper root rot were carried out in the pot and the results showed that control efficiency of isolate XH2, XH3, XH5, XG3 and shuisha1 were more than 65%, and the highest could reach 77.32%. In addition, the colonization ability of eleven antagonistic bacteria and promotion grow on plant were performed on the MS plate. The results showed that 11 strains have a role in promoting growth on pepper seeding, and can grow around the roots of pepper. The identification results suggested that one of the 11 isolates was Pseudomonas and the other 10 strains were Bacillus subtilis. All of these strains were not only enriched our strain of resources, but also offer a base of development of biological pesticide to control the pepper root rot in future.

Key words: pepper root rot; antagonistic Bacteria; identification; colonization ability; biocontrol efficiency

目 录

前 言

1 文献综述

1.1辣椒根腐病的背景

1.2土壤微生物的获取

1.2.1土壤微生物的分离和纯化

1.2.2细菌分离物培养

1.3无菌辣椒苗的获取

1.4根部定殖细菌的分布特点

2 材料与方法

2.1试验材料

2.1.1 辣椒根腐病病原菌

2.1.2 培养基配方

2.1.3 试验相关试剂

2.1.4 实验仪器

2.1.5 实验用品

2.2样本采集及菌株分离、纯化和培养

2.3细菌的拮抗能力测定

2.3.1辣椒根腐病菌孢子液的制备

2.3.2辣椒根腐病菌拮抗细菌初筛

2.3.3辣椒根腐病菌拮抗细菌复筛

2.4拮抗细菌种属鉴定

2.4.1拮抗细菌基因组DNA提取

2.4.2拮抗细菌基因组16S rRNA PCR扩增

2.4.3拮抗细菌基因组gyrB PCR扩增

2.5拮抗菌根部定殖、促生播种实验

2.5.1 MS培养基制备

2.5.2辣椒种子浸种、播种与培养

2.6盆栽防效实验

2.6.1辣椒苗的准备

2.6.2根腐病病菌沙土培养基制备

2.6.3辣椒苗期盆栽准备

2.6.4拮抗菌辣椒苗期盆栽防效实验初筛

3 结果与分析

3.1拮抗细菌的分离、纯化和筛选

3.2拮抗细菌对辣椒种子促生和根部定殖能力

3.3拮抗细菌对辣椒根腐病的盆栽防治实验

3.4拮抗细菌种属的鉴定

4 结论与展望

致 谢

前 言

辣椒根腐病是设施栽培辣椒常见病害之一，根腐病害常造成根系腐烂、植株枯死。一年四季各地区均有发生，多雨季节病害加剧。发病初期，病株顶部叶片稍见萎蔫。傍晚至翌日早晨恢复，症状反复数日后，叶片全部萎蔫逐渐失绿而后植株枯死。病株的根茎部皮层褐色腐烂，剥落露出木质部；横切茎观察，可见维管束变褐色，发病后期可见明显病菌孢子。目前实验表明辣椒根腐病是镰刀菌侵染辣椒根部引起，主要包括半知菌亚门真菌茄柄镰刀菌、木贼镰孢、串珠镰孢、和尖镰孢^[1,2]，以茄柄镰刀菌侵染为主。根腐病菌孢子在土壤中休眠时间可达数十年，传播渠道主要有流水传播，也可经过带菌的工具和肥料传播^[3]。不科学的养护土地、盲目复配农药导致土传病害加剧^[4]。辣椒根腐病菌分布在土壤表层，翻耕土壤做好土壤消毒工作、夏季焖棚消毒，可有效减少土壤病原菌含量。单种作物连作会导致土壤孔隙度变差、肥效降低，耕地粗放，大量使用化肥，盲目施用有机肥会加剧发病。由辣椒根腐病引起的连作障碍带来产量降低和品质下降。得到科学论证有效方法主要有水旱轮作、施用化学药剂来进行防控。其中水旱轮作防病被广泛使用，而对辣椒根腐病的化学药剂防治也是主要策略，但化学药剂所带来的农药残留、抗药性及环境污染等问题越来越引起人们的重视。

辣椒根腐病的发生与温、湿度与发病关系一般土温在18至20℃开始发病，土温上升至22至26℃时，形成发病高峰，当土温上升至30℃以上时发病率减少。研究表明，5月上旬至6月中旬，即定苗前后为发病高峰；7-8月高温期病势停止发展^[5]。对于难以治理的辣椒土传病害，仍在研发更为高效的化学防治药剂。在有效控制病害前提下，利用农业综合防治技术，尤其是生物防治技术，做到预防病害，减少化学试剂对环境的影响，显得尤为重要。

辣椒根腐致病机理和防治原理研究表明，用生防菌防治辣椒根腐病具有一定的可能性。土壤是个天然的培养基，是复杂的有机、无机复合体，土壤质量由物理、化学和生物三大因素决定。植物和细菌长期共生、共同进化过程中，其中有些细菌具有抑制病原菌、抢占病原菌生态位，同时能促进植株生长、提高抗逆性的特点。在共同进化的长期作用下，土壤会为病原微生物提供一种或几种抑制性微生物，而这些微生物正是自然筛选的生防菌资源库，因而这些细菌成为发展前景很好的植物病害生防菌^[6,7]。本研究以辣椒根腐病高发地区辣椒根际土壤为主要原料筛选拮抗细菌应该是最为适合，最为有效的。目前，对辣椒生防菌的研究主要针对疫病和青枯病，而对辣椒根腐病的研究鲜有报道^[8]。

生物农药源于自然，对环境影响小，发酵生产快速，剂型多样化等特点，在病虫害综合治理中，是一类理想的可替代或部分替代化学农药的植保产品^[9,10]大力发展生物农药，符合当前我国农业和环境可持续发展的要求，有利于整合农业资源，有利于促进我国农业科技体制改革，有利于加快农业产业结构的转型，从发展方向促进国家农业调速降档^[11]。而微生物农药因其资源丰富、可再生性强，易于规模化工业生产，在生物农药中占有重要地位。微生物农药、微生物肥料代表着未来一段时间内植物保护的发展方向，在环境保护和可持续性农业发展中发挥重要作用 ^[12,13] 。

辣椒根腐病是可以预防和防治的，如果合理采取农业防治、物理、生物防治和化学防治等多种综合防治方法，减少发病植株和死亡率。将会增加辣椒产量和质量，提高土地利用效率，兼顾环境效益，切实保障农民收入。

本研究拟以辣椒根腐病的主要致病菌为指示菌，筛选具有在辣椒根部定殖、可促生和拮抗作用的菌株，建立拮抗菌株资源库，将拮抗菌株制备发酵液进行温室盆栽防效试验，最终获得优秀的生防菌株，并进行种属鉴定。

1 文献综述

1.1辣椒根腐病的背景

近年来，设施辣椒栽培面积的不断扩大，多茬连作种植，又不及时处理感病植株，造成土壤病菌积累逐年增加，辣椒根腐病发生越来越重，造成的产量损失较大。

1.2土壤微生物的获取

为了研究土壤微生物生态对辣椒根腐病的影响，弄清不同群落土壤微生物的功能，并对土壤微生物群落的数量与组成进行定量的估计至关重要。由于土壤微生物的数量巨大，组成极为复杂，90%以上的土壤微生物不能采用培养法培养出来，因此应用传统微生物学研究中的培养法来研究土壤微生物群落的数量与组成几乎不可能^[14]。尽管测定土壤微生物生物量的熏蒸培养(FI)或熏蒸提取法(FE)能对土壤微生物总量进行较为精确的测定^[15,16]，但迄今尚不能直接提供土壤微生物群落数量组成的有关信息。因此，应用物理或化学方法从土壤中提取与纯化具有代表性的微生物，对于微生物生态学上研究土壤微生物的群落结构组成，并通过同位素标记的方法研究C、N、P、S等元素在土壤微生物不同群落中的转化动力学具有重要意义。同时，对于细胞生理学和分子生物学等研究领域亦具有重要科学价值^[17]。

1.2.1土壤微生物的分离和纯化

Strom等成功地将两相分离技术应用于微生物与有机废弃物及泥炭的分离。在此项工作的启发下，Smith和Strib-ley研究了应用两相分离技术从土壤中分离纯化非菌丝体微生物的效果。其分离纯化过程:土样加入胆酸钠、钠离子交换树脂和玻璃珠一起在4℃下振荡分散2 h，经分散处理的土壤悬液过孔径为20µm筛，其滤液中含有大多数的土壤细菌，可直接进入PEG/Dextran两相分离系统纯化。PEG(平均分子量为503 000道尔顿)与Dextran(分子量为8 000道尔顿)在两相分离系统中的比例分别为2%和6%(w/w)，加入适量土壤滤液及蒸馏水使分离系统总质量为100份。经充分混合后静置一定时间，即可形成上下两相体积比约为4：1的两相分离系统.细菌主要富集在上层PEG相，土壤残存颗粒将进入下层Dextran相。用吸管将上层PEG相转移出来，加入相同质量的PEG，对残留于底层的细菌重复提取纯化3次，所有操作过程均在4℃下进行。经4次提取纯化，富集在上层PEG相的细菌总量约达加入两相分离系统细菌总量的60%，而上层PEG相中的土壤矿质颗粒总量仅占总加入量的4%以下^[18]。

1.2.2细菌分离物培养

纯化后的细菌分离物，用牛肉膏蛋白胨培养基进行分离培养，每种细菌各浓度处理均分离皿(3次重复)。稀释分离后放入25℃温箱内培养，每天观察菌落生长情况，选择生长菌落数10至100个每皿的浓度及时计数^[19]。然后接种根腐病菌继续培养24h后观察。

1.3无菌辣椒苗的获取

辣椒种子萌发因品种、种子质量和土壤质地而存在差异。为获得最好的萌发，播种应于25～28℃下，将种子播于排水良好的灭菌的非泥土混合物中，并每日浇水。在此条件下，种子大约8 d萌发。20℃下种子13 d萌发;15℃下25 d萌发；若温度低于15℃或高于35℃，种子不萌发。

育苗盘填充采用如泥炭、商品盆土、或由土、堆肥、水稻壳、跖石、泥炭和(或)沙子组成的盆土混合物等播种介质。盆土混合物应具有良好的保水和排水性。应选用67%的泥炭和33%的粗蛭石混合物。如果含有未灭菌的成分，应对盆土混合物进行高压蒸气灭菌或在150℃下烘焙2 h灭菌。如果在一个土苗床中开始育苗，应该在苗床上燃烧5 cm厚的稻草或其他干燥有机物以清洁苗床^[20]。然后在无菌实验室条件下培养。

1.4根部定殖细菌的分布特点

营养型或营养要求的复杂性，在一定程度上会决定生防菌在土壤中的种群活动和变化趋势，尤其是对于根际定殖细菌，基质的营养条件是主要调节因子^[21]。因为根围营养成分的含量和种类远比根外土壤里的丰富。细菌在根围上的分布区段与细菌对营养的要求有密切联系，或者说与根不同部位渗出的分泌物的差异也有关系。Nijhuis由草的根际分离来的420个细菌分离物中，筛选出定殖能力最强的4个菌株，即能在根表很长时间内保持相当高的种群数量。这4个菌株在根较幼嫩的部位分布密度较大^[22]。Lijeroth则证明，在小麦根的较老部位定殖的细菌与在根尖定殖的细菌的生理型很不一样，尤其是对基质利用的专化性不同，比如细菌可利用简单的营养物质也可利用复杂的糖和有机酸^[23]。当土壤中存在原生动物的捕食作用时，细菌的存活也会受到影响。Sinclair和Alexander曾提出，当细菌被原生动物捕食时，生长较慢的细菌种群数量下降较快，而生长速度较快的细菌种群数量下降不明显或较慢^[24]，这与细菌繁殖的补偿作用有关。另外，原生动物由于捕食作用可为细菌快速繁殖提供更多可利用的营养物质。当土壤中产生碳元素协迫时，细菌细胞会缩小，进入抵抗逆境的状态与在指数生长期的细胞相比，不利于原生动物的消化吸收，这也是防御被捕食的一种表现。除去原生动物的捕食作用，土著微生物与引入的根际拮抗菌的竞争作用会阻碍拮抗菌在根际或土壤团粒上的定殖，还有微生物的生理因素往往与环境中的生物和非生物因素交织在一起，生理因素决定了微生物对外界不利或有利环境作出的生存适应^[25]。

2 材料与方法

2.1试验材料

2.1.1 辣椒根腐病病原菌

为从淮安辣椒根围土壤分离的根腐病茄柄镰刀菌菌株HALJ3-1。由江苏省农科院植保所提供。

2.1.2 培养基配方

PDA培养基（1L）：包括马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml 。