摘 要

本论文对来自马尾松转录组测序得到的部分EST序列进行SSR检索、SSR引物设计并利用马尾松小苗所提取的DNA和马尾松同一家系8粒胚乳DNA对100对引物进行初筛和复筛。结果表明：83860条马尾松EST序列中，含有SSR的EST序列832条，共包含889个EST-SSR；设计的引物中三核苷酸重复所占比例最高，为54.25%，四核苷酸重复最少，仅为3.75%；合成的100对引物中，有79对可以在马尾松上成功扩增，29对具有清晰的多态性带型。此外，还对100对引物进行属内、属间、科间通用性检测，其中属内通用性最高，为81%，科间通用性20.3%，属间通用性45.6%。

关键词：马尾松；EST-SSR；多态性；通用性

SSR primer development and generality analysis on Pinus massoniana

Abstract

In this thesis, part of Pinus massoniana EST sequences which measured according to transcriptome was retrieved to find SSR and SSR primer design. Use DNA extracted from Pinus massoniana seedlings and 8 endosperms from the same family to take screening and rescreening for 100 pairs of primers. The results showed that: Among 83860 Pinus massoniana EST sequences, there were 832 EST sequences, which contained SSR and contains a total of 889 EST-SSRs. In the designed primers, the proportion of trinucleotide repeat was the highest, 54.25%, the tetranucleotide repeat was the least, only 3.75%. In the 100 pairs of primers, 79 could been amplified on Pinus massoniana successfully and 29 had a clear polymorphism. In addition, the generality of intragenus, intergeneric and interfamily were also tested by 100 pairs of primers, intragenus generality was the highest（81%）, interfamily generality was the least（20.3%） and intergeneric generality was 45.6%.

Key words：Pinus massoniana; EST-SSR; Polymorphism;Transferability

目录

1 文献综述 4

1.1马尾松资源概况 4

1.2 马尾松分子标记研究进展 4

1.3 EST-SSR分子标记的特点 5

1.4 EST-SSR分子标记的研究进展 6

2 材料和方法 6

2.1 供试材料 6

2.2 DNA提取 7

2.3 SSR位点的获取 7

2.4 EST-SSR引物设计 7

2.5 EST-SSR 扩增 7

2.6 引物的筛选及通用性检测 7

2.7 引物群体筛选 8

3 结果分析 9

3.1 SSR引物设计及特征分布 9

3.2引物筛选及通用性检测 9

3.3 引物群体筛选 10

4 讨论 11

4.1 EST-SSR引物的通用性及多态性 11

4.2 EST序列中开发马尾松SSR引物的意义 12

致谢 13

参考文献 14

1 文献综述

1.1马尾松资源概况

马尾松（Pinus massoniana Lamb.）是松科（Pinaceae）、松属的双维管束松亚属（Subgen.Pinus）多年生常绿树种。幼树树冠为圆锥形，老则为广圆形，枝条每年生长一轮，一年生枝淡黄褐色，无白粉，冬芽褐色；针叶两针一束，长12-20cm，径长1mm，细柔，树脂道4-7，边生；成年树皮呈红褐色，下部呈灰褐色，裂成不规则鳞片块状；球果卵圆形或圆锥状卵形，长4-7cm，熟时栗褐色；鳞盾微隆起或平，微具横脊，鳞脐微凹，通常无刺。花期4-5月，球果翌年10-12月成熟。马尾松喜阳光，温暖湿润的气候，产区年均气温13-22°C，年降水量800mm以上，能耐-18°C的短时低温，喜酸性土壤（pH4.5-6.5），耐干旱贫瘠，不耐劳及盐碱土。

马尾松是我国南方主要的工业原料树种，木材可作为建筑、板材、家具、胶合板、造纸、木纤维工业用材，经过防腐后可作枕木，矿柱等用；树干可采割松脂，是我国松脂生产的重要资源，树干及根部可培养茯苓；同时马尾松也是绿化造林和荒山废地恢复植被的主要先锋树种，常飞籽成林。因此，在创造经济价值和发挥生态效应方面，马尾松在我国都占据着举足轻重的地位。马尾松分布广泛，在我国两广地区与海南省，常见有3个变种：产于两广南亚热带地区的岭南马尾松；产于海南雅加大岭的雅加松；产于广东高州地区的黄鳞松。此外，安徽、江苏、浙江等省在马尾松和黑松发生交界的地带，有二者的天然杂交种——黄松。它不仅是我国松属树种中分布最广泛的树种，也是我国亚热带东部湿润地区典型的针叶树中代表树种。在北纬21°41’——33°40’，东经102°10’——120°的广大地区内，除少数高山外，到处都可见它的踪迹，跨越江苏、安徽、河南、湖北、陕西、四川、台湾等省区。

1.2 马尾松分子标记研究进展

近几年来，分子标记在马尾松遗传改良工作中应用越来越多。李丹等^[1]采用RAPD技术分析测定了3个马尾松海拔梯度种群的分子遗传特征。申保响^[2]利用马尾松幼叶为材料，从99对随机引物中筛选出具有多态性的5对引物，对来自湖南省桂阳马尾松实生种子园的23个F1子代进行了RAPD扩增反应，共产生35条带，其中27条带具有变异性，占扩增总数的77.1%，可完全把种子园23个F1子代全部鉴别出来。尹佟明等^[3]利用300个随机寡核苷酸引物和马尾松大配子体产生的随机扩增多态性DNA分子标记，进行马尾松遗传图谱的构建，经筛选共获得64个稳定的RAPD标记，利用多点连锁分析，其中的48个标记分属于13个不同的连锁群，该图谱覆盖的基因组总长度为692.5cM，标记间平均距离为14.7cM。赵阿凤^[4]从松属其他物种中筛选出8对具有较高多态性的引物，对马尾松无性系测定林的120个无性系进行了研究，各位点扩增的等位基因数为4-12个，共检测到59个等位基因，平均每个位点检测到7.3750个等位基因；并用8对SSR引物的指纹组合建立了120个无性系的DNA指纹图谱，可以简便有效地区分出全部供试的不同无性系，并进行了马尾松树高、胸径等7个形状与分子标记的相关检测。李炟^[5]采用磁珠富集马尾松微卫星序列，构建马尾松微卫星文库，以及从火炬松EST序列中挖掘微卫星，结果得到50条含有SSR的EST序列并设计引物，用7个马尾松不同个体进行检测，最后得到17对多态性好的引物。刘公秉^[6]从松属其他树种EST序列中开发马尾松EST-SSR引物，获得了39对多态性引物。

1.3 EST-SSR分子标记的特点

简单序列重复(SSR)，又称为微卫星DNA，是一类由1-6个核苷酸串联重复组成的DNA序列，其长度一般在100 bp以下，广泛分布于生物体基因组的不同位置，由于重复次数及重复程度的不完全造成了每个位点的多态性。SSR两端序列多是相对保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计特异引物，对基因组DNA进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性可用作分子标记。SSR标记具有易检测、共显性遗传、重复性好、多态性高以及遍布整个基因组等优点^[7]，是构建遗传连锁图谱、研究群体遗传结构、开展交配系统分析、谱系分析以及分子标记辅助育种的理想工具^[8-10]。EST-SSR标记出了具有上述特点外，还有其特殊优势：⑴与表达的基因直接相关。由于EST是由生物体内特定时期、组织内所表达基因测序获得的片段，如果一个EST标记与一个有意义的遗传性状有关，那么这个EST就可能与控制此性状的基因相关；⑵通用性好。由于EST来自转录区，其保守性较高，故从EST中开发的SSR标记比基因组中的SSR标记通用性高，这在亲缘物种之间矫正基因组连锁图谱和比较作图方面有很高的利用价值^[11]。⑶EST-SSR标记开发简单、快捷、费用低，特别是随着近年植物基因组与功能基因组研究的发展，大规模植物基因的测序产生了大量的EST序列，通过网上公共数据库就可以免费获得，已成为开发EST-SSR标记的一种重要资源。

1.4 EST-SSR分子标记的研究进展

目前，EST-SSR的开发在农作物和林木中均具有报道。如Xu Yong^[12]利用扁桃（Amygdalus communis L.）种质的1057条EST设计了26个SSR引物，通过扩增获得了11个SSR标记，这些SSR标记被用于研究扁桃种质的遗传多样性，并发现来源于基因组的SSR和来源于EST的SSR在每个位点上检测到的等位基因的数目有很大区别。Scott^[13]分析5000条葡萄（Vitis spp.）EST得到124个微卫星DNA，从中设计16个SSR引物，通过扩增获得10个SSR标记，检测了他们的多态性和可转移性，并与来源于基因组的SSR进行了比较。Decroocp^[14]从杏（Prunus armeniaca L.）和葡萄的EST中得到了一些SSR，并研究了来源于EST的SSR在葡萄科（Vitaceae）和蔷薇科（Rosaceae）之间转移的可能性。胥猛^[15]用9531条北美鹅掌楸（Liriodendron tulipifera）EST序列开发得到66对表现多态性的EST-SSR引物，并在中国马褂木（L. chinense）和玉兰（Magnolia denudata）中检测了不同种之间的通用性。刘公秉等[6]对松树359521条EST处理，得到无冗余EST 序列56776条，其中有2315个SSR分布于2057条EST中，出现频率是4.08%，平均距离是22.06 kb。选择整体长度不小于24 个碱基的SSR 位点用于开发马尾松SSR 引物，设计出135 对备选引物，最终有51 对引物在马尾松中得到扩增，有效扩增率为37.78%；其中39 对有多态性，多态率为28.89 %。

2 材料和方法

2.1 供试材料

马尾松球果采自福建省龙岩市上杭县白砂林场的马尾松实生种子园，剥出种子进行发芽试验，置于人工气候箱里，环境条件设为16h光照，温度为22℃，培养2周左右，取幼苗作为初筛材料。进行引物群体检测的胚乳材料为马尾松实生种子园的一个家系种子，将种子置于人工气候箱培养4-5d，待其萌动时，剥去种皮和胚，挑取胚乳，放入2mL离心管中备用。同时还收集了松属不同种质材料的种子包括赤松、红松、华山松、樟子松，经发芽获得幼苗用于试验。另外收集了雪松属的雪松，杉科的杉木和柳杉两个种。

2.2 DNA提取

DNA提取采用CTAB-SDS法。

2.3 SSR位点的获取

本试验所用序列为根据马尾松转录组测得的EST序列，利用misa.pl（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）进行SSR识别和定位，利用misa.ini对识别SSR的参数标准进行设置，设置标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的精确 SSR基序的最小重复数分别为9，6，5，4和4次。结果在83860条马尾松EST序列中获得含有SSR的EST序列832条，共包含889个EST-SSR。

2.4 EST-SSR引物设计

利用软件Primer3.0（http://frodo.wi.mit.edu/primer3）对检索得到的含有SSR的EST序列进行引物设计，引物设计的主要原则为：SSR位点的开始和结束位置距离5’和3’端分别不少于30bp；尽量避免引物二级结构以及6个连续碱基配对的出现；引物设计采用位于SSR上游和下游各150个碱基范围内的序列；引物长度18-24bp，最适长度为20bp；Tm值为50-60℃，最适温度为55℃；上下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40%-60%，最适为50%；PCR扩增产物长度为100-300bp。

2.5 EST-SSR 扩增

本次试验所设计的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反应体系为 10μL：Mg2 浓度为2.80mmol/L，dNTP浓度为0.35mmol/L，引物浓度为0.075umol/L，模板DNA浓度为20ng/10μl，Taq酶浓度为0.50U/10μl。PCR扩增反应程序为：⑴ 94℃预变性4min；⑵ 梯度降温扩增：94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行20个循环，每个循环退火温度降低0.5℃。⑶ 一般性扩增：94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸30sec，进行20个循环。⑷ 72℃延伸10min后4℃保存。

2.6 引物的筛选及通用性检测

将扩增产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，挑选出有扩增条带的引物。对挑选出的引物用松属4个种、落叶松属1个种、杉科2个种进行通用性检测。

2.7 引物群体筛选

随机选取马尾松一个家系的8粒种子的胚乳，对有扩增条带的引物进行群体筛选，采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。具体操作过程如下：

⑴涂板