摘 要

以马尾松胚乳为试验材料，用CTAB—SDS法提取单粒胚乳DNA，对其浓度和纯度进行检测。结果表明：运用CTAB—SDS法提取的马尾松胚乳DNA浓度高，纯度好，琼脂糖凝胶电泳条带清晰，点样孔干净。此外，还对影响PCR结果的Mg² 、dNTP、模板DNA、引物浓度、TaqDNA聚合酶五个因素进行了正交设计试验，建立了适合马尾松SSR-PCR的反应体系：即在10μl反应体系中，Mg² 浓度为2.80mmol/L，dNTP浓度为0.35mmol/L，引物浓度为0.075umol/L，模板DNA浓度为20ng/10μl，TaqDNA聚合酶浓度为0.50U/10μl。,

关键词： 马尾松；胚乳DNA；CTAB-SDS法；SSR-PCR

Efficient extraction endosperm DNA from Pinus massoniana and SSR-PCR system optimization

Abstract

Take endosperm of Pinus massoniana as an experimental material and extract DNA from one single endosperm by CTAB-SDS, then, detect its concentration and purity. The experimental result indicated that the concentration and purity of DNA extracted from Pinus massoniana endosperm by CTAB-SDS were good, the agarose gel electrophoresis strips were clear and sample holes were clean. Besides, the experiment also took an orthogonal design towards Mg² , dNTP, template DNA, primer concentration, TaqDNA polymerase which could affect the PCR result. A suitable reaction system for Pinus massoniana SSR-PCR was established: in the 10μl reaction system, 2.80mmol/L Mg² , 0.35mmol/L dNTP, 0.075umol/L primer, 20ng template DNA, 0.50UTaqDNA polymerase.

Keywords: Pinus massoniana; endosperm DNA; CTAB-SDS; SSR-PCR

目录

1.文献综述 4

1.1马尾松资源概况 4

1.2马尾松胚乳DNA提取 4

1.3 SSR分子标记研究进展 5

1.4 SSR体系优化方法 6

1.5 SSR-PCR体系优化研究进展 6

2试验材料 7

2.1材料来源 7

2.2材料处理 7

3试验方法 7

3.1胚乳DNA提取 7

3.1.1 CTAB-SDS法主要提取试剂 7

3.1.2 CTAB-SDS法提取步骤 7

3.2 SSR-PCR体系优化 8

3.2.1 SSR-PCR影响因素水平确定 8

3.2.2 PCR影响因素正交设计 8

3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 9

3.3.1试验试剂 9

3.3.2试验步骤 10

4结果与分析 11

4.1胚乳DNA提取效果分析 11

4.1.1DNA浓度与纯度测定 11

4.1.2琼脂糖凝胶电泳检测结果 11

4.2胚乳DNA SSR-PCR最佳体系确定 12

5讨论与结论 12

5.1讨论 12

5.2结论 13

致谢 15

参考文献: 16

1.文献综述

1.1马尾松资源概况

马尾松（Pinus massoniana Lamb.）是松科（Pinaceae）、松属的双维管束松亚属（Subgen. Pinus）多年生常绿树种。马尾松成年树皮呈红褐色，下部呈灰褐色，裂成不规则鳞状块片；幼树树冠为圆锥形，老则广圆形，枝条每年生长一轮，一年生枝淡黄褐色，无白粉；冬芽褐色。针叶两针一束，长12-20cm，径约lmm，细柔，树脂道4-7，边生。球果卵圆形或圆锥状卵形，长4-7cm，径2.5-4cm；熟时栗褐色；鳞盾微隆起或平，微具横脊，鳞脐微凹，通常无刺；种子连翅长2-2.7cm。花期4-5月，球果翌年10-12月成熟。马尾松最喜阳光，喜温暖湿润的气候，产区年均气温13-22℃，年降水量800mm 以上，能耐-18℃的短时低温，喜酸性土(pH4.5-6.5)的山地，耐干旱贫瘠，不耐涝及盐碱土。马尾松是我国松属树种中分布最广的树种，也是我国亚热带东部湿润地区典型的针叶树代表树种（乡土树种）。其自然分布为北纬21°41′——33°40′，东经102°10′——120°的广大区域内。除少数高山外，到处都可见到它的踪迹，跨越江苏、安徽、海南、重庆、河南、湖北、陕西、四川、湖南、江西、浙江、福建、广东、广西、贵州、云南、台湾等省（区）。在我国，马尾松天然分布的北界从秦淮山脉到淮河流域；南界为广西百色以东，雷州半岛以北的东南沿海一线，海南岛北部仅有零星分布；西界到贵州金沙、黔西、安顺、黄果树一线和四川青衣江、大相岭一带；东部可分布到台湾省东北部的阿里山。在我国森林树种的大家族中，马尾松是名声显赫的主要成员，独具两个极为突出的特点：一是马尾松适应性极强，是贫瘠荒山的绿化先锋，它总是在立地很差或岩石裸露地带顽强地生长，四季长青，它在恢复森林生态系统中能起到引导作用。二是马尾松用途广泛，堪称全身是宝。马尾松木材物理学性质的弯曲强度、弯曲弹性模量、顺文压力、端面硬度四种指标都超过南方的杉木、北方的红松。马尾松木材广泛用于建筑、坑木、枕木、桥梁等。松脂、松针粉、松花粉是化工、饲料、医疗保健食品的原料珍品，以马尾松松脂为原料生产的松香，是我国出口的林产品之一。马尾松纤维含量较高，可用于制造各种高级纸张。利用松材培养的茯苓，是我国医药宝库中历史悠久的名贵中药材。

1.2马尾松胚乳DNA提取

利用分子标记辅助选择育种可提高马尾松遗传改良效率，为实现此目标，首先要解决DNA样品制备和分子标记开发等基础性问题。马尾松胚乳为单倍体，来源于母体的单一减数分裂，其分离和自由重组不受近交和自由授粉的影响，是进行遗传图谱构建、数量性状定位、遗传多样性分析等分子试验的良好材料，所以马尾松胚乳DNA高效提取是进行后续分子试验的基础步骤，也是决定试验成败的关键。与动物和微生物细胞不同的是，植物细胞具有细胞壁，植物组织内还含有大量多糖和酯类、酚类等次生代谢产物，使得植物DNA的提取比较困难^[1-3]，并且马尾松种子相比较于其它松属植物种子小，又提高了其胚乳DNA提取的难度。尹佟明等^[4]从马尾松大配子体中提取DNA，利用RAPD分子标记构建马尾松遗传连锁图谱，但其提取步骤比较繁琐，耗时长，且抽提次数多，DNA损失多。文亚峰等^[5]运用改良SDS法提取马尾松胚乳DNA，其抽提步骤复杂，浓度较低。蔡娟娟^[6]用CTAB法和SDS法提取马尾松胚乳DNA，得出SDS法比CTAB法条带清晰，但是，他们所提取的马尾松胚乳DNA浓度约为30ng/μl，对于作图群体较大的遗传图谱构建等分子试验DNA量存在不足现象。如何从马尾松单粒胚乳中高效提取DNA，是遗传图谱构建，遗传多样性分析等进一步分子试验至关重要的一步。

1.3 SSR分子标记研究进展

简单序列重复(SSR)，又称为微卫星DNA，是一类由1-6个核苷酸串联重复组成的DNA序列，其长度一般在100bp以下，广泛分布于生物体基因组的不同位置，由于重复次数的不同及重复程度的不完全造成了每个位点的多态性。SSR两端序列多是相对保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计特异引物，对基因组DNA进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性可用作分子标记。

基因组微卫星探针具有高度的种属特异性，使得探针的制备以及对未知基因组微卫星指纹图谱的构建具有相当的难度；EST-SSR具有较高的保守性，在种间甚至于属间都存在一定的通用性。无论基因组SSR还是EST-SSR，都为共显性分子标记，在植物群体中杂合水平高，且按孟德尔方式遗传，可用于分离和连锁分析。由于在基因组中存在着较为专一位点，所以SSR是一种非常好的锚定标记，有助于图谱的连锁群或染色体的归并和不同连锁群的整合，并且可为染色体原位杂交提供探针，为遗传图谱和物理图谱的结合奠定基础。Panaud O^[7]、Ostrander EA^[8]、Collevatti RG^[9]等学者研究表明：SSR标记具有易检测、共显性遗传、重复性好、多态性高以及遍布整个基因组等优点，是构建遗传连锁图谱、研究群体遗传结构、开展交配系统分析、谱系分析以及分子标记辅助育种的理想工具。这些优点使SSR标记在医学、生命科学的相关领域高精度的分析中具有无可替代的价值^[10]。近年来，SSR标记已经广泛应用于植物遗传学研究的各个领域，在无性系指纹图谱绘制、遗传图谱构建和数量性状基因定位等方面研究取得了较重要的进展，也为分子标记辅助选择育种奠定了理论基础。

1.4 SSR体系优化方法

SSR 体系优化的方法有多种，一般均采用多次单因素设计的方法。在Taq 酶、Mg² 、随机引物、dNTP、DNA 模板5种组分中，逐一变化其中一种组分浓度而固定其余4种，得到每一组分的最佳浓度，最后组合成为最佳反应体系。这种方法的优点在于试验进展快，在短时间内就可得到一个反应体系。但这种方法既不能考察PCR体系中各组分的交互作用，也不能完全保证各组分最佳的组合就是最佳反应体系。