摘 要

本研究以银杏幼叶为外植体，探究不同激素浓度对银杏幼叶愈伤组织诱导和生长的影响。研究结果表明，高浓度的生长素(如NAA，IBA)是诱导银杏外植体脱分化产生愈伤组织的重要条件. 培养基中激素只加生长素NAA而不加细胞分裂素KT或6-BA也能诱导愈伤组织的发生，但单独使用细胞分裂素(如KT，6-BA)不能诱导愈伤组织形成。光照对愈伤组织的诱导影响不大。诱导银杏幼叶愈伤组织的最佳激素组合为MS NAA(0.5 mg/L) KT(0.005 mg/L)。

关键词：银杏；幼叶；激素；愈伤组织

Effects of different hormone concentration on Induction of Callus and Callus Growth in Ginkgo biloba leaves

Abstract：In this study, using the ginkgo leaves as explant, we have studied the effects of different hormone concentration on induction of callus and callus growth in young leaves of Ginkgo biloba. The results showed that, high concentrations of auxin (such as NAA, IBA) is an important condition for induction of Ginkgo biloba explants which will produce the callus.The callus induction could be succeeded with the auxin (NAA) only. But using cytokinins (eg KT ,6-BA) alone can not induce the formation of callus . Light has little effect on the induction of  callus . The best hormone combination of  inducting callus in Ginkgo leaves was MS NAA (0.5 mg / L) KT (0.005 mg / L).

Keywords: Ginkgo biloba; young leavefs; hormone; callus

目 录

前言…………………………………………………………………………………………………3

.一. 文献综述…………………………………………………………………………………….3

1. 影响叶片愈伤组织形成的各项因素………………………………………………………3

1.1 培养基类型……………………………………………………………………………..3

1.1.1 基本培养基……………………………………………………………………..4

• • 1. 培养基PH……………………………………………………………………….4

1.2 激素种类………………………………………………………………………………4

1.2.1 生长素…………………………………………………………………………..4

1.2.2 细胞分裂素……………………………………………………………………..4

1.3 培养条件………………………………………………………………………………5

1.3.1 光照……………………………………………………………………………..5

1.3.2 温度……………………………………………………………………………..6

1.4 其他因素……………………………………………………………………………..6

1.4.1 外植体…………………………………………………………………………..6

1.4.2 碳源……………………………………………………………………………..6

2. 植物组织培养过程中常见问题…………………………………………………………6

• 1. 外植体褐变………………………………………………………………………….6
  2. 试管苗的玻璃化…………………………………………………………………….7

3. 银杏组织培养研究进展…………………………………………………………………7

二．材料与方法………………………………………………………………………………….8

1. 植物材料………………………………………………………………………………….8

2. 实验方法………………………………………………………………………………….8

• 1. 幼叶的采集与处理………………………………………………………………….8

2.2 外植体的消毒……………………………………………………………………….8

2.3 诱导培养基………………………………………………………………………….8

2.4 接种外植体............................................................................................................... 9

2.5 培养条件…………………………………………………………………………… 9

3. 结果与分析………………………………………………………………………………10

3.1 各激素组合及浓度对银杏幼叶愈伤组织诱导的影响……………………………10.

3.2 光暗处理……………………………………………………………………………11

4. 结论与讨论………………………………………………………………………………11

4.1 结论…………………………………………………………………………………11

4.2 讨论…………………………………………………………………………………12

前 言

银杏(Ginkgo biloba. L)为银杏科（Ginkgoaceae）银杏属（Ginkgo）植物。原产我国,是最古老的中生孑遗植物之一,属于国家二级保护植物。银杏树树型优美,不仅具有较高的观赏价值,而且具有很高的药用价值。银杏叶含有两大生理活性物质(类黄酮和萜内酯),对肺虚咳喘、冠心病、心绞痛和高酯血症具有治疗和预防的作用^[1]。因而随着世界人口老龄化,以银杏叶提取物为原料的加工产品(如各种胶囊、片剂、针剂,银杏茶、银杏干红葡萄酒)更具有现实意义,市场前景非常广阔。

细胞培养是生物技术的重要研究内容之一,是进行细胞大规模培养,次生物质生产的前提,通过研究银杏细胞组织培养,测定愈伤组织黄酮含量,可为开展银杏大规模有效成分发酵生产等相关工作提供帮助^[2]。

1 文献综述

1 影响叶片愈伤组织形成的各项因素

组织培养的材料称为外植体,主要形式有器官、胚胎、细胞、原生质体等^[3]。愈伤组织是指外植体在离体培养条件下, 形成的一团无极性、 能旺盛分裂的薄壁细胞团, 在培养过程 中, 经过诱导分化可以发育成完整的再生植株^[4]。一般认为,诱导愈伤组织的成败关键不在于植物材料的来源,而在于培养条件。植物组织培养中,影响培养力的因素是多方面的,而植物激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键因素^[5]。获得愈伤组织的关键是固体培养基中激素的优化组合^[5]. 近年来,虽然有一些关于银杏愈伤组织培养的研究报道^[7,8],但均缺乏系统性.下文系统研究了银杏组织培养中培养基的类型、激素种类、培养条件及其他相关因素对银杏愈伤组织诱导和生长的影响,为探讨愈伤组织生长与银杏黄酮和内酯类合成之间的相互关系打下了基础,并可为进一步的工业化生产提供实验依据^[9]。

• 1. 培养基类型

培养基是植物组织培养的物质基础, 也是愈伤组织能否成功的重要因素之一. 愈伤组织能否形成, 一方面取决于培养基材料本身的性质, 另一方面也取决于培养基的种类和成分, 因此要根据不同的外植体以及不同的培养目的选择合适的培养基。

1.1.1 基本培养基

目前植物组织培养采用的基本培养基主要有 MS、H、B5、N6 、White 培养基等, 每种培养基的营养成分、 盐浓度不同. 其中 MS培养基无机盐浓度较高, 元素间的比例较合适, 营养丰富, 缓冲性强, 且微量元素种类齐全, 可用于愈伤组织的诱导, 有利于愈伤组织的形成. 但盐浓度过 高会导致外植体褐变, 不利于愈伤组织的增殖和分化。 张郁松, 寇炜材^[10]指出用 MS培养基, 大豆愈伤组织生长好, 其次为 1 /2MS、B5培养基, 而在 N6培养基中生长缓慢。

1.1.2 培养基PH

培养基的 PH 值反应培养基的酸碱度, 直接影响外植体对营养元素的吸收, 且影响MS 培养基的凝固状态, 进而直接或间接地影响愈伤组织的形成, 所以要严格控制培养基的 pH 值. 培养基的 PH值因培养材料不同而异, 大多数植物种类要求 PH 值在 5.0 -6.0^[4]. 适当降低培养基 PH值可以降低多酚氧化酶的活性和底物利用率, 从而抑制褐变. 任敬民^[11]等证明, PH 越接近 6.0 越有利于愈伤组织的形成, 但某些植物种类则要求 PH较高一些, 盛长忠^[12]等指出红豆杉愈伤组织形成的最适 PH 为7。

• 1. 激素种类

植物激素是愈伤组织诱导过程中的重要影响因子, 能够诱导细胞分裂的启动、愈伤组织的形成和生长. 常用于组织培养的植物激素有两大类: 即生长素类和细胞分裂素类, 二者的浓度比例不同, 对愈伤组织的诱导结果不同。

• • 1. 生长素类

植物生长素类是植物组织培养中常用的植物激素, 通常被用来诱导愈伤组织形成及其增殖。 生长素类的主要作用是重新启动有丝分裂, 使已停止分裂的植物细胞恢复分裂能力,常用的生长素有 2,4- D ( 2 4 -二氯苯氧乙酸 )、 NAA ( 萘乙酸 ) 、IAA (吲哚乙酸 )、IBA ( 吲哚丙酸 ) . 不同植物种类对生长素的浓度反应不同, 对多数植物材料的培养而言, 2,4-D 和 NAA 是生长素中诱导愈伤组织和实现细胞悬浮培养最有效的物质。常用浓度为 0.2-3.0 mg/L。何泼^[13]、李琰^[14]等以杜仲试管苗为外植体进行愈伤组织的诱导中发现,NAA 浓度在 0.1-1.0mg/L时,出愈时间较长, 愈伤组织成黄绿色无光泽; 浓度在 1.0-2.5 mg/L 时, 出愈时间较前者早 3-5 d 愈伤组织奶油色, 质地疏松, 生长量大,继代后生长旺盛。愈伤组织诱导的培养基中, 高浓度的生长素类结合低浓度的细胞分裂素类对提供胚性愈伤组织的发生是需要的。

• • 1. 细胞分裂素

细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂和扩大, 诱导芽的分化, 促进侧芽萌发生长.常用的细胞分裂素有激动素 ( KT )、 6苄基腺嘌呤 ( 6-BA) 、 玉米素 ( zT ) 等. 细胞分裂素在诱导愈伤组织的时候, 一般要和生长素配合使用, 增强生长素的诱导作用和效果当诱导出胚性愈伤组织之后, 进行愈伤组织的增殖 (继代 )、分化再生植株时,细胞分裂素起到重要作用. 张洋^[15]利用唐古特大黄种子诱导愈伤组织中, 1 mg/L 的 6-BA 有利于愈伤组织的快速诱导, 但单独使用 6-BA 无诱导作用. 需要注意的是, 细胞分裂素对某些植物胚性细胞的诱导有抑制作用. 因此, 要根据实际需要选用适当的细胞分裂素种类。

高浓度的生长素(如2,4-D,NAA)是诱导银杏外植体脱分化产生愈伤组织的重要条件.单独使用细胞分裂素(如BA,KT)不能诱导愈伤组织形成,但适当浓度的细胞分裂素与生长素配合可提高愈伤组织诱导率和生长量,表明细胞分裂素是维持脱分化细胞分裂所需要的.褐变是植物组织培养中的一大障碍,组织中的酚类物质被氧化成醌类物质,可抑制其他酶的活性,毒害培养物,严重影响细胞生长和分化^[9,16]。