摘 要

本研究以紫叶海棠幼芽为外植体，探讨不同浓度下两种抗氧化剂对外植体褐化的影响，从而为缓解紫叶海棠在外植体培养过程中常因褐化严重而出现死亡的现象提供一种方案。研究结果表明，在培养基中填加抗坏血酸（Vc）和聚乙烯吡咯烷酮PVP均可有效抑制外植体褐化，有利于紫叶海棠外植体生长且抗褐化效果最佳的抗氧化剂浓度分别为：Vc 0.1g/L，PVP 1g/L。

关键词：海棠；外植体；抗褐化

The Research about Controlling Browning of Crabapple Explants Cultured in Vitro

Abstract: In this study, using the sprouting buds as explant,we have

studied the impact of different antioxidants and different concentrations

on browning of explants. Also best growth environment for sterile bud of

Crabapple has been researched. The results showed that adding VitaminC (Vc) or Polyvinylpyrrolidone (PVP) could both control browning Of explants effectively. The best antioxidants concentrations for growth of Crabapple ‘purple leave’ is Vc 0.1g/L or PVP1g/L.

Key words: Crabapple；Explant；anti-browning

目 录

前言 3

一、文献综述 3

1 植物组织培养中外植体褐化的机理 4

2 植物组织培养中控制外植体褐化研究进展 4

2.1外植体的生理状态 4

2.2 取材时间与部位 4

2.3 植物种类与基因型 5

2.4培养基成分 5

2.4.1无机盐种类及含量 6

2.4.2激素的种类和浓度配比 6

2.4.3培养基添加物 6

3褐化的防止措施 7

3.1选择合适的外植体 7

3.2外植体预处理 7

3.3合适的培养条件 8

3.4适宜的培养基 8

3.4.1 适当的无机盐浓度 8

3.4.2 适当和适量的激素 8

3.4.3 培养基的硬度 8

3.4.4 培养基中水的硬度的影响 9

3.4.5 培养基的pH值 9

3.5使用抗氧化剂 9

3.6连续转移 10

二、材料与方法 11

1植物材料 11

2实验方法 11

2.1枝条的采集与处理 11

2.2无菌苗的获取 11

2.2.1 外植体消毒 11

2.2.2培养基及培养条件 11

2.2.3 不同抗氧化剂对外植体褐化的影响 12

3 结果与分析 12

三、.结论与讨论 13

1结论 13

2讨论 13

致 谢 14

前 言

海棠（crabapple）为蔷薇科（Rosaceae）苹果属 (Malus Mill)植物；原产中国，现北方地区多有栽培。自从德国植物学家Haberland于1902年根据细胞学说提出细胞全能性概念，近一个世纪以来经过各国科学家努力，植物组织培养技术在科学研究和生产上开辟了令人振奋的多个新领域，成为举世瞩目的生物技术之一。在植物快速繁殖、去除病毒、加速育种的进程、次生代谢产物的生产和种质资源的保存等各方面取得了巨大的经济效益、社会效益及生态效益。植物组织培养技术使海棠在生产中得到广泛应用，并产生较大经济效益，同时也能快速繁殖其新品种，在植物组织培养过程中，重要的问题之一就是解决外植体褐化，这是培养成功的关键。海棠是深受人们喜爱的花卉之一，主要靠组织繁殖种苗，解决其外植体褐化问题具有理论和实践意义。本研究中，从组织培养角度入手，探讨不同浓度抗氧化剂对控制海棠外植体褐化的效果，从而为提高海棠组织培养材料的成活率，解决海棠组培苗生产障碍提供技术支撑。

一、 文献综述

1 植物组织培养中外植体褐化的机理

褐化主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。在植物组织培养中，褐化是由2种机理引起的：非酶促褐变和酶促褐变。非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐化现象，并不涉及酚类物质的产生，诸多不利条件都可以造成细胞的程序化死亡，但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生。而酶促褐变主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的，也是植物组织培养中褐化的主要原因。在正常条件下，完整的植物细胞中，细胞中的酚和醌之间保持一种动态平衡，醌类物质水平较低；而酚氧化酶及其底物分布在正常组织的不同部位，酚类物质分布在细胞的液泡内，酶则分布在各种质体或细胞质内，这种区域性分布致使底物与酶被质膜分隔开来；但当外植体或培养材料处于机械损伤等逆境，或细胞受伤或衰老时，细胞膜结构或细胞中物质区域化分布的破坏会导致酚氧化酶释放或合成，如果此时在合适的pH和温度等条件下，酚氧化酶、酚类(底物) 和氧发生酶促氧化反应，导致一系列的脱水、聚合反应,并抑制许多酶的活性，最后形成黑褐色物质,从而引发褐化，影响植物材料的正常生长，严重时则导致培养物死亡。尤其是木本植物组织的外植体褐变死亡是其培养难度较大的主要因素。此外，组织的老化或病变也可激活酚氧化酶而引起褐变。

2 植物组织培养中控制外植体褐化研究进展

2.1外植体的生理状态

外植体生理状态不同，接种后褐化的程度也不同。通常幼龄部位产生褐变轻,随着组织老化褐变加重。刘兰英在薄壳香核桃组织培养的实验中发现，木质化程度高的外植体会促进褐化的发生。欧洲栗在幼年褐化程度轻，成年程度高。油棕幼嫩外植体（胚）培养较少褐化，而用高度分化的叶片接种后，则容易褐化^[1]。黑松以成熟胚为外植体比芽为外植体褐化低^[2]。辣椒下胚轴生长旺盛，具有较强分生能力，不易褐化，褐化程度低于子叶。金叶风箱果以刚解除休眠的冬芽为外植体时，褐化率低，而以露地栽培母株上的嫩枝作为外植体，褐化率高。柿树组织培养也是休眠芽的褐化率低于嫩枝茎尖^[3]。大量实验表明，材料在培养过程中的褐化程度与多酚氧化酶活性及酚含量有关。

2.2 取材时间与部位

在木本植物中酚类物质的积累与植物的发育阶段和季节相关^[4],不同时期取材的外植体褐化程度不同。刘淑兰等对新疆核桃的试验证明，不同季节、不同树龄的外植体，褐化发生的情况不同，通常幼龄外植体比老龄外植体褐化轻，褐化率低。4月-8月取材的外植体褐变最严重，而在10月到来年2月取材的外植体褐变最轻。金叶风箱果在4-7月间无论是取自温室栽培母株上的嫩枝段，其褐化率均增高，而以7月为最高。Chang等在紫衫培养中来自成年树的外植体褐变与季节明显相关。Chevre在欧洲栗的培养中发现，1月的芽培养褐化少，而5、6月份的芽培养起来褐化严重。对羊蹄甲的组织培养中发现在一年中5月到8月褐变最严重，而在冬季休眠时最低（11月-4月），金花梨茎尖和芽组织培养褐化率一年有3次高峰，最高为100%，出现在4月份，最低褐化率出现在1月，为0。因此，季节是影响外植体褐化的一个重要因素^[5]。来自休眠的冬季外植体很难进行分化，这在许多的植物中都已经得到证实，如合欢、桉树、美洲衫等。此外，外植体类型和取材部位也是影响褐化重要因素。外植体的大小对褐化的发生及褐化的程度也有一定影响。小的材料更容易发生褐化，相对较大的材料褐化的程度较轻。

2.3 植物种类与基因型

植物的基因型对外植体褐化发生频率、程度都存在根本性影响，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。这是由于基因会从根本上导致植物体内相关物质合成量有差异。在木本植物中，单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变^[6]，这是由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁或色素的合成体，酚类化合物含量高将导致褐化的发生，因此，木本植物一般比草本植物更容易发生褐变。在植物组织培养中，不同物种之间褐化程度差异很大，就是同种植物的不同品种间也存在一定差异^[7]，在比较两类葡萄品种的褐化时，发现酚类物质含量与褐化发生具有正相关性^[8]。同一种植物中幼龄材料一般比成龄材料褐化轻^[9]。马文卿等证实，大花蕙兰是易褐化的植物材料，由基因型导致外植体诱导和试管苗增殖中均存在褐化现象^[10]。

2.4培养基成分

培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。

2.4.1无机盐种类及含量

基本培养基中无机盐的种类和浓度的选择对外植体生长的影响很大,培养基中的无机物可能是一些氧化酶合成及进行生理生化作用所必需的^[11]。浓度过高的无机盐可以引起外植体酚类外溢进而发生氧化,促进褐化的发生^[12]。因此,盐份越大,褐化程度越高。大量实验结果表明,同种外植体在不同培养基上产生褐变的程度不同。

2.4.2激素的种类和浓度配比

培养基中植物生长物质的种类、浓度及其组合对褐变起着重要的作用。培养基中附加激素种类的不同搭配,产生褐化程度也不同。有报道,细胞分裂素类物质会促使褐化的发生^[11]。生长素2,4-D或IAA可延缓酚的合成,减轻褐变产生^[13]。培养基中较高浓度的激素也会促进褐化发生。

2.4.3培养基添加物

为减轻褐化程度,可向培养基内加入一些化学添加剂。一般有吸附剂、抗氧化剂、螯合剂和激活剂四大类。常用的吸附剂有AC(活性炭)和PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂,能吸附培养基中的有害物质,减轻褐变。粉末状与颗粒状AC相比,吸附性更强,一般在培养基中加入2-3 g/L的AC。张红针对库拉索芦荟组培中的褐变现象,在培养基中加入活性炭500.0mg/L,环境温度控制在25℃,有利于减轻褐变。考虑到AC也吸附培养基中的生长调节物质,对外植体的生长带来竞争性抑制,应结合具体情况改变培养基的物质配比。Zaid认为,在加有AC的培养基中,生长调节剂的浓度应适当提高。最近,试验证明了PVP没有普遍防止褐变的效果,原因是植物体内存在着不同的酚类物质,而PVP也存在不同分子量的类型,这是由于PVP在吸附酚类物质时,具有较高专一性。在大花蕙兰试管苗增殖过程中的褐化研究中,选取AC和PVP 2种抗氧化剂:Vc和硫代硫酸钠,结果表明,添加1 500 mg/L的AC效果最好,能够使得试管苗生长旺盛,保持较高的增殖系数。

3褐化的防止措施

   为了提高组织培养的成苗率，必须对外植体的褐变现象加以控制。可以采用以下措施防止、减轻褐变现象的发生。

3.1选择合适的外植体

一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。王异星^[14]用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。

3.2外植体预处理

通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70%酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1%漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。何琼英等^[15]用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。

3.3合适的培养条件

无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO₂也会促进褐变，其原因是环境中的CO₂向细胞内扩散，细胞内CO₃^2-增多，CO₃^2-与细胞膜上的CO₃^2-结合，使有效CO₃^2-减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变^[16]。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。

3.4 适宜的培养基

培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型。

3.4.1 适当的无机盐浓度 

张妙霞等^[3]在柿树组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS(大量元素减半) 和1/2MS的效果最好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。徐振彪^[13]在对玉米幼胚耐NaCl愈伤组织的筛选表明，随NaCl浓度升高，褐变现象加重。

3.4.2 适当和适量的激素 

王异星^[14]在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加1 mg/L BA 0.5mg/L 2,4-D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1mg/L BA 1mg/L 2,4-D 时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。

3.4.3 培养基的硬度 

在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低^[17]，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。

3.4.4 培养基中水的硬度的影响 

硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡^[17]。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。

3.4.5 培养基的pH值 

在水稻体细胞培养中，pH值为4.5-5.0 时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为5.5-6.0时，愈伤组织严重褐变^[17]。一般来说，酸性环境(pH值为4.5-5.0)不利于褐变过程的发生^[18]。

3.5使用抗氧化剂

褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚^[19]。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在水稻细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu² 结合，从而降低了其活力。陈学森等^[20]在对植酸在银杏组织培养中应用的研究中也证实了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。

常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等, 从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响^[21]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变^[22]。

3.6连续转移

在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。

二、材料与方法

1植物材料

本实验中外植体为2013年3月采集的紫叶海棠枝条上刚萌发的幼芽。

2实验方法

2.1枝条的采集与处理

2013年3月采集无病虫害、芽比较饱满的紫叶海棠一年生枝条，

将枝条的基部浸没于水中。

2.2无菌苗的获取

2.2.1 外植体消毒

将枝条上的芽轻轻取下，在自来水下冲洗2小时，清洗干净后剪去外植体多余叶片，放置灭菌的烧杯中，在超净工作台上先用70%酒精浸泡30秒，无菌水清洗3次，然后放入0.1%的升汞溶液中浸泡6分钟，浸泡过程中需要不断的搅动，以保证表面灭菌彻底，表面灭菌后无菌水清洗5次,待用。

2.2.2培养基及培养条件

采用 MS 为基本培养基，附加 BA 1.0mg/L NAA 0.1 mg/L 蔗糖30 g/L 琼脂 7.0g/L，灭菌前pH调至5.8。光照培养周期为 16h，光强为1000LX。培养温度为 25±2℃。

2.2.3 不同抗氧化剂对外植体褐化的影响

将表面灭菌的外植体接种到添加有不同浓度Vc和PVP-30的MS 6-BA1.0mg/L NAA0.1mg/L培养基中，Vc与PVP-30的浓度各设置3种（见表1），每个处理接种20个；以不添加任何抗氧化剂作为空白对照（CK）。定期观查植株的生长情况。

表1 抗坏血酸和聚乙烯吡咯烷酮处理浓度

抗氧化剂	抗坏血酸(Vc)	聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)
	0.05	0.5
处理浓度(g/L)	0.1	1.0
	0.2	2.0

3 结果与分析

抗氧化剂抑制褐化的作用在其它植物组培中已有许多报道。我们选用了2种抗氧化剂加入培养基中，对6个处理的MS培养基上无菌苗的生长状况及外植体褐化情况进行定期观察。结果表明，培养基中加入抗坏血酸（0.05-0.2 g/L）、聚乙烯吡咯烷酮（0.5-2.0 g/L）均可不同程度减少外植体褐化的发生，但结合外植体的生长状况，我们认为抑制效果最佳的是使用 1.0g/L的PVP 。（表 2）。