摘 要

由稻瘟病菌引起的稻瘟病是水稻生产上的三大病害之一，每年给全球粮食生产造成巨大损失，因此研究稻瘟病菌致病机理对防治该病害具有重要意义。核酸合成途径在生物体中起着不可或缺的作用。MoURA3作为嘧啶合成途径中的一个重要酶，在核酸合成途径中作用尤其显著。为了明确该基因在稻瘟病菌致病过程中的作用，利用基因组数据，找寻候选核酸合成基因MoURA3，利用同源重组原理和原生质体转化方法对其进行敲除，随后对得到的突变体的生长，产孢和致病性等表型进行分析，从而阐明MoURA3基因在稻瘟病菌致病过程中的作用。为防治稻瘟病开发新药剂找寻靶标。

关键词：稻瘟病菌；MoURA3；核酸合成；敲除；

Nucleic acid synthesis related gene MoURA3 of rice blast fungus Gene knockout and verification

ABSTRACT

Caused by the rice blast fungus magnaporthe grisea is one of the three major diseases in rice production, caused huge losses to the global food production every year, so the prevention and control of rice blast fungus pathogenesis of this disease is of great significance. The synthesis of nucleic acid plays an indispensable role in biology. As a major enzyme in the pathway of pyrimidine synthesis, the role of the MoURA3 is particularly significant in the nucleic acid synthesis pathway. In order to define the role of the gene in the rice blast fungus pathogenic process, using the data from the genome to find candidate genes MoURA3 nucleic acid synthesis, using the principle of homologous recombination and protoplast transformation method to knock out, then to obtain the growth of the mutants, spore production and pathogenicity of phenotypic analysis, so as to clarify MoURA3 pathogenic role in the process of genes in the rice blast fungus. Looking for targets for the development of new agents for the prevention of rice blast.

Key words: Magnaporthe grisea；MoURA3；Nucleic acid synthesis ；gene knockout；

目 录

1 引 言 - 1 -

1.1 稻瘟简介 - 1 -

1.1.1　稻瘟病 - 1 -

1.1.2 稻瘟病发病症状 - 3 -

1.1.3　稻瘟病防治措施 - 3 -

1.2 稻瘟病及稻瘟病菌 - 4 -

1.2.1 稻瘟病及稻瘟病菌分类地位 - 4 -

1.2.2 稻瘟病菌侵染循环过程 - 5 -

1.2.3 稻瘟病菌全基因组序列介绍 - 5 -

1.2.4 稻瘟病菌致病相关基因的研究 - 6 -

2 材料与方法 - 7 -

2.1 培养基和实验试剂 - 7 -

2.1.1 产孢培养基 - 7 -

2.1.2 CM培养基 - 7 -

2.1.3 燕麦培养基 - 7 -

2.1.4 TB3培养基 - 7 -

2.2 实验仪器 - 7 -

2.3 实验方法 - 7 -

2.3.1 DNA凝胶回收 - 8 -

2.3.2 质粒提取 - 8 -

2.3.3 稻瘟病菌菌丝DNA的提取(CTAB精提法) - 9 -

2.3.4 pcr - 10 -

2.3.5 所需基因引物序列 - 11 -

2.3.6 自噬相关蛋白的二级结构和三级结构预测 - 12 -

2.3.7 致病性实验 - 13 -

3 结果与分析 - 14 -

3.1 MoURA3敲除载体构建 - 14 -

3.2 基因敲除载体转化子的PCR验证 - 19 -

3.3 敲除转化子致病性测定 - 20 -

结 论 - 21 -

致 谢 - 22 -

参考文献 - 23 -

附录 - 24 -

1 引言

稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产，严重时减产40%～50%，甚至颗粒无收。世界各稻区均匀发生。本病在各地均有发生，其中以叶部、节部发生为多，发生后可造成不同程度减产，尤其穗颈瘟或节瘟发生早而重，可造成白穗以致绝产。近年来，广东稻瘟病年发生面积不少于50万亩，而且出现逐年增加趋势，局部大爆发并不少见，目前，稻瘟病可能发生在省域内的任何年头、任何季节。

而稻瘟病菌的基因表达受多级调控，转录因子是基因仅表达调控而关键因子。通过基因敲除的方法，将转录因子的基因筛选掉，并做致病性实验，观察稻瘟病菌的致病性和表型的变化，是一种研究基因功能的有效手段。

在提供一系列适于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的基因敲除、过表达和荧光蛋白融合表达，并且操作简单、耗时短、稳定可靠的通用载体，为系统研究稻瘟病菌的基因功能提供便利。通过 PCR、克隆、酶切、连接等分子生物学方法，克隆了2个在菌丝和附着胞阶段都强力表达的启动子(SOD1 启动子和H3启动子)；构建了14种载体：3种稻瘟病菌基因敲除载体(pBS­SUR、pBS­BAR和pBS­NEO)、4 种丝状真菌基因过表达载体 (pKD5、pKD6、pKD61和 pKD8) 和7种丝状真菌荧光融合蛋白载体(pKD5­GFP、pKD5­RED、pKD6­GFP、pKD6­RED、pKD7­RED、pKD8­GFP 和 pKD8­RED)；并提供了这些载体在丝状真菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达中的应用方法。使用构建的基因敲除载体通过原生质体及ATMT 转化最多同时在稻瘟病菌中敲除了4个基因；用 pKD5­RED、pKD6­GFP 和 pKD6­RED 转化稻瘟病菌后，发现 SOD1 启动子和 H3 启动子控制下的绿色和红色荧光蛋白在稻瘟病菌中强力表达，Real­time PCR 结果证实SOD1启动子指导下的eGFP mRNA 表达量是茁­tubulin 的 2.5 倍，SOD1启动子指导下的DsRED2 mRNA表达量是茁­tubulin的5.4 倍，而H3启动子指导下的DsRED2 mRNA表达量是茁­tubulin的20.8倍；MoATG8­DsRED2 的融合蛋白(使用pKD6­RED)可以正确定位 MoATG8于小泡附近；SOD1启动子驱动的DsRED2(使用 pKD6­RED)可以在稻瘟病菌的菌丝、孢子、附着胞等各个发育阶段表达。这些实验说明14种载体可以用于稻瘟病菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达，也可用于镰刀菌等其他丝状真菌的基因功能研究^[1]。

本研究中，为验证MoURA3基因的功能，需敲除MoURA3基因。鉴于实验室之前研究表明，真菌敲除常用的基因转化手段——PEG介导的原生质体^[12]转化应用于稻曲病菌转化时不能获得较好的转化效率，在多次尝试后终于获得稻瘟病菌MoURA3基因敲除突变体^[2]。