摘 要

稻绿核菌（Ustilaginoidea virens）引起的稻曲病已经成为我国水稻的重要病害之一。稻曲病可使稻粒变为菌球，不但可使水稻减产，且产生对人、畜有害的生物碱毒素，而稻曲菌球表面产生大量的厚垣孢子是稻绿核菌重要的越冬形态。Homeo-box家族基因为一类含有Homeo-box结构的转录因子，我们前期实验数据表明，其中一个Homeo-box基因可能参与调控稻曲菌的厚垣孢子的形成。通过基因敲除、回复和基因沉默的方法，验证该基因在厚垣孢子形成中的功能：同源重组酶法初步构建载体，并使用Crispr技术构建稻曲菌基因敲除载体。本次研究将构建稻曲菌基因敲除的载体，为UVcspo1基因相关后续如培养、验证和测试实验奠定基础，同时也可为农药的创制提供潜在靶标。

关键词：稻绿核菌；厚垣孢子；Homeo-box；基因敲除

The knockout of UVcspo1 related to the formation of ustilaginoidea virens (Cke.) Tak chlamydospores

ABSTRACT

Ustilaginoidea virens caused by ustilaginoidea virens (Cke.) Tak has become one of the important diseases of rice in China. Ustilaginoidea virens can make rice grains turn into fungus balls, not only causing the reduction of rice output, but also producing alkaloid toxins harmful to humans and animals. A large number of will be produced on the surface of fungus balls of ustilaginoidea virens, which is an important overwintering form of ustilaginoidea virens. Previous studies have shown that some gene may be involved in regulating the formation of chlamydospores of ustilaginoidea virens. This study will verify the function of the gene in the formation of chlamydospores by the methods of gene gene complementation and gene silencing: the gene knockout vector of ustilaginoidea virens is constructed by homologous recombinant enzyme method. This study will lay the foundation for further study of formation mechanism of chlamydospores of ustilaginoidea virens, and will also provide potential targets for the creation of pesticides.

Key words: ustilaginoidea virens, chlamydospores, Homeo-box, knockout,

目 录

1 引 言 - 1 -

1.1 稻曲病简介 - 1 -

1.1.1　稻曲病分布 - 1 -

1.1.2 稻曲病症状 - 1 -

1.1.3　稻曲病防治措施 - 2 -

1.2 稻曲病和稻曲病菌 - 2 -

1.2.1 稻曲病菌的分类 - 2 -

1.2.2 稻曲病菌侵染循环过程 - 3 -

1.2.3 稻曲病菌产生的孢子类型 - 3 -

1.2.4 厚垣孢子的生物学特性 - 4 -

1.2.5 厚垣孢子形成相关基因 - 5 -

2 材料与方法 - 7 -

2.1 培养基和实验试剂 - 7 -

2.1.1 PS(A)培养基 - 7 -

2.1.2 LB培养基 - 7 -

2.1.3 MM固体培养基（生长速率测定） - 7 -

2.1.4 TB₃固体培养基 - 8 -

2.1.5 CM培养基 - 8 -

2.1.6 IM培养基（现配现用） - 8 -

2.1.7 1×TAE电泳缓冲液 - 9 -

2.2 实验仪器 - 9 -

2.3 实验方法 - 9 -

2.3.1 稻曲菌UVcspo1基因同源置换敲除载体的构建 - 9 -

2.3.2 转化子培养 - 12 -

2.3.3 DNA凝胶回收 - 13 -

2.3.4 质粒提取 - 12 -

2.3.5 CTAB法提取稻曲病菌基因组DNA - 13 -

3 结果与分析 - 15 -

3.1 稻曲菌UVcspo1基因载体的初步构建 - 15 -

3.2 Crispr cas9技术构建基因敲除载体 - 17 -

4 结 论 - 24 -

致 谢 - 25 -

参考文献 - 26 -

1 引 言

水稻稻曲病，又名黑穗病、绿黑穗病、谷花病及青粉病，是由植物病原真菌Ustilaginoidea virens（有性态：Villosiclava virens）引起的水稻穗部病害。我国与日本还称其为“丰收病”。该病害于 1879 年在印度首次被报道。19 世纪初期开始，稻曲病在中国，日本和美国也分别被报道，但是仅有零星发生，属于水稻生产中的次要病害。上世纪 80 年代以来，随着高产水稻品种的推广以及农田耕作措施的改良，该病害大范围流行，并且发生趋于严重，现在已经成为包括中国、印度、埃及以及其他国家水稻生产中的主要病害。稻曲病菌最初从水稻花丝开始侵染，危害水稻穗部，在稻粒上形成褐色至墨绿色的稻曲球，并可使邻近稻粒的垩白质和粒重下降，发病重的年份可导致减产；另外，稻曲球含有对人畜有剧毒作用的生物碱毒素，严重影响稻米品质。

1.1 稻曲病简介

1.1.1　稻曲病分布

水稻稻曲病在田间一般零星发生，多发生于单个谷穗，很少有相邻的几个谷穗同时发病。稻曲病广泛分布于世界水稻产区。亚洲、欧洲、美洲和非洲都有稻曲病严重爆发的报道。在我国各大水稻产区近几年也有该病严重发生的报道^[3]。

1.1.2 稻曲病症状

水稻稻曲病主要危害穗部。病原菌侵染初期，病斑很小并局限于寄主花序的颖片内，后逐渐扩大，直径可达1 cm以上，可将所在的花序部分完全包裹，形成稻曲球。稻曲球初期扁平，光滑，呈淡黄色，外面被一层被膜包裹。随着稻曲球继续生长膨大，被膜破裂，露出病原菌的厚垣孢子，形成稻曲。稻曲开始为橘黄色，后颜色逐渐加深，变为黄绿色、暗绿色、墨绿色至黑色。最后病粒外层覆盖一层戎状厚垣孢子粉。稻曲的切片观察表明，菌丝与稻粒的胚乳层界限分明，大部分稻曲球中部有大块的发育良好的胚乳，并充满密集的淀粉粒。根据稻曲球中病菌发育程度的不同，从内到外可以分为3层：最里层浅黄色，由放射状生长的菌丝和正在形成的厚垣孢子组成；中间一层是橘黄色，由菌丝和孢子构成；最外层绿色至墨绿色，由成熟的孢子和老熟的菌丝组成。病粒上常有菌核存在，扁平状，表面黑色。菌核未常熟时在病粒内侧，成熟后外露，易脱落。一般1个病粒含有1个菌核，有的病粒含有2～ 4个菌核。一般每个病穗含有1～ 5个病粒，严重的可达20粒以上^[3]。稻曲病病菌萌发、发育的最适温度为25~30℃，34℃以上或12℃以下病菌不能生长。在孕穗末期至水稻抽穗期，如遇到湿度大，温度适宜，日夜温差小的气候条件，极有利于该病的发生流行，是典型的气候型病害。同时该病在品种之间的抗性有明显的差异，该病的发生与施氮肥不合理呈正相关，氮肥偏多，水稻中后期生长嫩绿的田块，低洼湿度大的田块，发病重。

1.1.3　稻曲病防治措施

农业防治措施：铲除菌源，将病残体清除出稻田；选用适合于当地的抗性品种，合理密植，适时播种，合理肥水管理，不过多使用氮肥，避免后期氮肥用量过多造成水稻贪青晚熟。

生物防治：采用对稻曲病菌有拮抗作用的拮抗细菌制剂防治稻曲病，目前已开发出相应剂型应用于实际，如纹曲宁等。