摘 要

青钱柳是我国南方一种特有的，集药用、保健、材用和观赏价值于一体的多功能经济树种。青钱柳的繁殖方式以有性繁殖为主，但其繁殖率受雌雄异型异熟特性的限制，其分子机制尚不清楚。本研究利用Illumina Hiseq 4000平台对青钱柳萌动期的样品（PA-M、PA-F、PG-M、PG-F）进行转录组测序，并采用功能注释、差异表达分析、表达量分析等方法对测序结果进行分析，筛选可能与花芽分化相关的基因并进行荧光PCR验证。转录组测序中，每个样本生成超过10Gb的原始数据，共组装了63533个Unigenes，注释率约为72.3%。通过GO注释和KEGG Pathway富集性分析，被注释的36615个Unigenes分别归为66个GO分类和352条代谢途径，并将代谢途径分为5个分支和31个子分支。筛选出9个与开花相关的基因（6PGDH、G6PDH、NPR、PIF3、NRT、FLC、EARLY FLOWERING、LFY和MFT）进行qRT-PCR验证，验证结果与RPKM值表达趋势基本一致。该研究提高了我们对青钱柳花芽不同发育阶段的特征以及与开花有关的生物学过程的认识。通过差异基因分析，找到影响两种交配类型雌雄花芽萌动期的差异基因，揭示其成花过程的主要分子机制，可为人工调控花期提供理论指导，同时为进一步研究其他异型异熟植物花芽分化分子机理奠定了基础。

关键词：青钱柳；异型异熟；花芽分化；转录组测序；差异表达基因

Analysis of Genes Related to Flowing in Cyclocarya paliurus (Batal.) lljinskaja on Transcriptome Seqencing

ABSTRACT

Cyclocarya paliurus (Batal.) lljinskaja, a unique species growing in southern China, is a multi-function economic tree with medicinal, healthcare, material and ornamental value. Sexual reproduction is the main method in C. paliurus, but limited by the character of heterodichogamy, the molecular mechanism of which remains largely unknown. Female and male buds of both mating types in bud break stage were sequenced using Illumina Hiseq 4000 platform. 10 Gb data RNA sequencing is generated for each sample. A total of 63,533 unigenes were assembled and approximately 72.3% were annotated. 36615 unigenes were annotated in 352 KEGG pathways, and divided into 5 branches and 31 sub-branches. The expression of genes and transcription factors related with flowering were selected to illustrate the differential role they play in bud germination respectively. The RPKM values of 9 genes showed strong linear correlation with qRT-PCR. The study improved our understanding of characteristics of different development stages in C. paliurus floral bud (inflorescence) and biological processes related with flowering. Our findings shed light into molecular regulatory mechanism in the bud break stage, and laid a foundation for further study in heterodichogamy plant.

Key words：Cyclocarya paliurus；heterodichogamy；buds development；RNA-seq； differentially expressed genes

目 录

1 前言 - 1 -

1.1 研究背景及意义 - 1 -

1.2 雌雄异型异熟植物开花机制 - 1 -

1.2.1 模式植物的开花机制 - 1 -

1.2.2 雌雄异型异熟植物开花机制的研究现状 - 2 -

1.3 转录组测序 - 2 -

1.3.1 转录组测序技术概况 - 2 -

1.3.2 RNA-seq技术在转录组学研究中的应用 - 2 -

2 材料和方法 - 4 -

2.1 供试材料 - 4 -

2.2 试验方法 - 5 -

2.2.1 RNA提取、纯化、反转录 - 5 -

2.2.2 文库构建与上机测序 - 5 -

2.2.3 数据过滤 - 5 -

2.2.4 De novo组装 - 5 -

2.2.5 基因表达量估计与ORF功能性注释 - 5 -

2.2.6 差异表达基因分析 - 6 -

2.2.7 实时荧光定量PCR验证 - 6 -

3 结果与分析 - 8 -

3.1 青钱柳不同交配类型雌雄花芽发育进程 - 8 -

3.2 RNA-seq测序数据及质量评估 - 9 -

3.2.1 测序数据质量分析 - 9 -

3.2.2 组装结果分析 - 9 -

3.3 基因功能注释 - 10 -

3.3.1 GO分析 - 11 -

3.3.2 COG注释 - 12 -

3.3.3 KEGG注释 - 13 -

3.4 差异基因表达聚类分析 - 14 -

3.5 差异表达基因（DEGs）的鉴定 - 15 -

3.6 不同交配类型雌雄花芽主要差异表达转录因子（DETFs） - 15 -

3.7 qRT-PCR验证RNA-Seq结果 - 18 -

4 讨论 - 20 -

4.1 青钱柳花芽转录组测序分析 - 20 -

4.2 青钱柳成花途径分析 - 20 -

4.3 与DEGs开花相关TFs的表达模式 - 21 -

结 论 - 24 -

致 谢 - 25 -

参考文献 - 26 -

1 前言

1.1 研究背景及意义

青钱柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja]为胡桃科（Juglandaceae）青钱柳属（Cyclocarya）植物，仅存于中国^[1]，广泛分布于长江以南海拔420-5200 m^[2]，为一种单种属植物。其树皮、树叶具有清热解毒，止痛消炎功能^[3]，临床医学实验表明青钱柳中含有大量具有生物活性的次生代谢产物，具有良好的的药用价值。国家卫生和计划生育委员会在2013年第4号公告中已将青钱柳叶列入新食品原料，因此青钱柳作为一种药食同源，具有功能多样性的新资源，在近年来其研究关注度已有了较大的提升。

青钱柳自然资源少，大部分处于散生状态，零星分布于深山老林以及一些自然保护区中。青钱柳在自然状态下结实率很低，且种子空粒率高^[4]，这是限制青钱柳规模化种植的主要因素。青钱柳开花特性的物候学观察和解剖学研究表明雌雄异型异熟的开花特性可能是造成这种现象的主要原因^[4，5]。因此了解青钱柳的开花习性、花芽分化特点，阐明其花芽分化过程的分子机制是至关重要的，可为提高其种子产量和质量提供理论依据，为青钱柳产业化生产奠定理论基础，同时也为其他异型异熟开花植物的开花机理提供理论参考。