摘 要

芽孢杆菌是一种重要的生防细菌，其抑菌谱广,因对多种植物的病害具有防效且促生效果明显而被深入研究。经前人研究发现解淀粉芽孢杆菌Lx-11可产生蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素等物质，而脂肽类抗生素是其最重要的抗菌物质^[35][36]。不同种类的芽孢杆菌菌株产生的脂肽类抗生素的种类和结构多种多样，本实验旨在从12种菌株发酵液上清中提取脂肽类抗生素,利用平板对峙生长法测定粗提物的抑菌活性；应用液谱-质谱联用技术，对各菌株脂肽类物质粗提物进行质谱分析，确定各菌株的主要抑菌物质。平板对峙生长法结果表明,脂肽类物质粗提物对细菌和真菌的生长均具有一定的抑制作用。质谱分析结果表明其中10个菌种中含有surfactins，5个菌种中含有Fengycins，7个菌种中含有Iturins。该研究通过对不同芽孢杆菌种属的菌株产生的脂肽类抗生素的差异的分析，能够为生防芽孢杆菌的防病机制的研究及生防应用提供理论基础。

关键词：芽孢杆菌；脂肽类抗生素；抑菌活性

Extraction and Analysis of Lipopeptide Antibiotics Produced by Bacillus

ABSTRACT

Bacillus is a important kind of biocontrol bacteria, which has a wide range of antimicrobial spectrum, and has obvious effect on the many kinds of plant diseases, is widely studied. Previous studies found that Bacillus amyloliquefaciens liquid can produce protease, cellulase and addicted to the ferrite material and lipopeptide antibiotic is the most important antimicrobial substances.Different kinds of bacillus strains can produce a variety of types and structures of the lipopeptide antibiotics,the purpose of this study is to extract the lipopeptide antibiotics from the supernatant of fermented broth.The Lipopeptide Antibioticsextracts were extracted by acid precipitation from the the supernatant of fermented broth of strains.The antifungal activities of crude extract was determined by dual culture on plate.The analysis of each lipopeptide crude extracts of strain was applied by mass spectrometry to determine the main antibacterial material of the strain.To make PCR validation analysis of each strain by designing the lipid synthesis peptide antibiotics gene specific primers.The PCR products analysis showed that the sfp, ituA or fenB genes exist in the genome of strain.By mass spectrometry analysis, 13 strains were found to have surfactins, 7 strains contained Fengycins, and 9 strains contained Iturins.The mycostatic tests showed that lipopeptide crude extracts has certain inhibitory effect on the growth of bacteria and fungi.

The study on differences of lipopeptide antibiotics of different Bacillus species strains of the genus analysis, can provide a theoretical basis for anti Bacillus disease control mechanism research and biocontrol application.

Key words：Bacillus；lipopeptide antibiotics; antifungal activities

目 录

前 言 1

1 文献综述 2

1.1芽孢杆菌（Bacillus）的生物学特性 2

1.2生防芽胞杆菌的应用 2

1.3 芽孢杆菌的控病作用机制 3

1.4 芽孢杆菌产生的抑菌物质 3

2 材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1供试菌株 5

2.1.2培养基 5

2.1.3 实验试剂 5

2.1.4实验仪器 5

2.2试验方法 6

2.2.1 芽孢杆菌对供试菌株的拮抗性能测定 6

2.2.2 芽孢杆菌脂肽类物质的初步分离与提取 6

2.2.2.1芽孢杆菌拮抗菌株发酵液的制备 6

2.2.2.2菌株发酵液中脂肽类物质的提取 7

2.2.3 芽孢杆菌脂肽类物质的抑菌作用 7

2.2.4 芽孢杆菌脂肽类物质的质谱分析 7

3 结果与分析 8

3.1芽孢杆菌对供试菌株的拮抗性能测定 8

3.2芽孢杆菌脂肽类物质的抑菌作用 11

3.3 芽孢杆菌脂肽类物质的质谱分析 13

4 讨 论 16

致 谢 17

参考文献 18

前 言

植物病害与人类生活息息相关，人们在日常农业生产中长期使用化学农药对植物乃至土壤和人类自己的健康造成不可忽视的影响。同时，农药的残留造成污染环境、破坏生态平衡、危害人类健康。生物防治因其对环境、生态和人类健康具有安全性，从而引起了世界的广泛关注。因此，催生了人们对于生防菌种的研究。其中芽孢杆菌是重要的生防菌种，在对多种植物病害的防御和抑制中有重要的生物性功能。同时生防芽孢杆菌因其的抑菌谱范围广、对多种植物的病害具有较好的防效并且促生效果明显，被广泛深入研究，是一类重要的生防细菌。目前，应用较多的生防细菌主要有芽抱杆菌Bacillus、假单胞杆菌pseudomonas、土壤放射杆菌Agrobacteriun radiobacter等^[1]。

芽孢杆菌本身对真菌和细菌具有拮抗作用^[3]，同时能够产生多种抗菌物质，如抗生素类^[16]、抗菌肽类^[17]、几丁质酶^[18]。脂肽类抗生素是抗生素类的一种，常见的脂肽类抗生素有表面活性素（sufactin）、泛革素（fengycin）及伊枯草菌素（iturin）等，芽孢杆菌分泌的脂肽类抗生素是其抑制病原菌生长的主要抑菌物质之一^[4]。