摘 要

樟疫霉是我国重要的森林病害防治病原菌之一，可对农林业经济造成极大损失。CRISPR/Cas 系统是一种新型的基因组编辑技术，Cas9 核酸酶能够通过20 bp 的引导序列而导向特异的基因组位点，使DNA发生双链断裂。G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor, GPCR)和磷脂酰肌醇磷酸激酶（phosphatidylinositol phosphate kinase, PIPK）是两类参与不同途径的信号传导通路，对物种的生长发育阶段起着重要调控作用。本研究从樟疫霉全基因组数据库中挖掘出大量GPCR-PIPK候选编码基因，在此基础上针对樟疫霉GPCR-PIPK基因位点，设计两条sgRNA（single guide RNA）。随后将其构建入sgRNA 表达载体，从而利用CRIPSR/Cas 系统对GPCR-PIPK1基因位点进行编辑，筛选出致病性相关新型GPCR-PIPK1，明确致病性相关新型GPCR-PIPK候选编码基因的生物学功能，为新型杀菌剂的研发提供可能的分子靶标，从而为有效防控樟疫霉引起的病害提供理论依据。

关键词：樟疫霉；CRISPR/Cas；PIPK；遗传转化

Research PcGPIPK1 gene of Phytophthora cinnamomi based on CRISPR/Cas technique

ABSTRACT

Phytophthora cinnamomi is one of the important pathogens of forest plant disease prevention in our country,which can do great damage to agricultural and forestry economy.CRISPR/Cas system is a new type of genome-editing technique, Cas9 nuclease can be guided to artificial genomic loci by guide sequence of 20bp and intribute to the double strand break of DNA.GPCR and PIPK take part in different signal transduction pathways,both have regulatory effect on species^,different growth stages.The research screens out large amounts of GPCR-PIPK candidate coding genes from the database of Phytophthora cinnamomi ,based on it ,we point at GPCR-PIPK genomic loci of Phytophthora cinnamomi and design two single guide RNA.Then construct them to sgRNA expression vector,thus we can use the CRIPSR/Cas system to edit GPCR-PIPK1 genomic loci and screen out pathogenicity related GPCR-PIPK1 gene,define the biological function of the pathogenicity related GPCR-PIPK1 gene,provide the possible mplecular target for the development of the novel fungicide,consequently provide theory basis of preventing diseases caused by Phytophthora cinnamomi effectively.

Key words:Phytophthora cinnamomi ；CRISPR/Cas；PIPK；genetic

transformation

目录

1 植物病原卵菌分子遗传学研究进展 1

1.1卵菌分类地位及危害 1

1.2植物病原菌的生活史 1

1.3 卵菌的遗传操作 3

1.3.1稳定遗传转化系统 3

1.3.2瞬时遗传转化系统 4

1.3.3 卵菌基因沉默现象的发现和应用 5

1.3.4卵菌基因沉默机理的研究 5

1.3.5卵菌基因沉默方法的优化 6

1.3.6 TILLING技术 7

1.3.7 CRISPR/Cas9技术 7

1.4卵菌组学的研究进展 8

1.4.1卵菌基因组学 9

1.4.2 卵菌转录组学进展 10

1.4.3 卵菌蛋白质组学 11

2 基于CRISPR/Cas技术研究樟疫霉PcGPIPK1基因 13

2.1材料与方法 13

2.1.1实验菌株 13

2.1.2 培养基的制备 13

2.1.3仪器与设备 13

2.1.4数据库信息和同源检索 13

2.1.5数据库信息和同源检索 14

2.1.6 樟疫霉RNA-Sequencing测序样品的准备 14

2.1.7 RNA的提取 15

2.1.8载体设计 15

2.1 .9 sgRNA靶点选择及其寡核苷酸链合成 17

2.1.10 载体构建 18

2.2.1质粒DNA的提取 20

2.2.2樟疫霉原生质体稳定转化体系鉴定 21

3 结果与分析 24

3.1 sgRNA靶点以及寡核苷酸序列设计 24

3.2生物信息学预测结构域 24

3.3 sgRNA寡核苷酸单链退火形成双链 25

3.4菌落PCR验证阳性重组质粒载体 26

3.5初步建立转化体系 26

结论与讨论 28

致谢 29

参考文献 30

1 植物病原卵菌分子遗传学研究进展

1.1卵菌分类地位及危害

卵菌(Oomycetes)隶属茸鞭生物界（kingdom Stramenopila），卵菌门（Oomycota）。卵菌门的卵菌纲下分为3个亚纲：Saprolegniomycetidae，Rhipidiomycetidae和Peronosporomycetidae，大多数的植物病原卵菌属于Peronosporomycetidae 亚纲下的两个目：霜霉目（Peronosporales）和腐霉目（Pythiales）。霜霉菌分布在霜霉目的盘梗霉属（Bremia）、单轴霉属（Plasmopara）和霜霉属（Peronospora），它们都是专性寄生菌。大部分植物根部的病原卵菌隶属于腐霉属（Phythium），腐霉科（Phytiaceae）^[1] 。

卵菌中有很多是病原菌，给人类社会造成了数以万亿计的巨大损失。它们中有很多可以引起农作物、灌木以及林木上严重的病害，对农业、林业以及生态系统都造成了很大的威胁^[2]。例如19世纪四十年代由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的爱尔兰饥馑至今仍对人类社会文明史和植物病理学的发展有着非常深刻的影响。即使在今天，由致病疫霉引起的马铃薯和番茄的晚疫病仍然是世界范围内流行的一类重要病害，每年造成的损失高达30亿美元^[3]。疫霉属中其他重要的植物病原疫霉菌还有樟疫霉(P. cinnamomi)，大豆疫霉(P. sojae)，棕榈疫霉(P. palmivora)，橡树疫霉(P. ramorum)和大雄疫霉(P. megakarya)等。腐霉属（Pythium）也包括许多重要的植物病原菌，如Pythium aphanidermatum，Pythium debaryanum， Pythium myriotylum和Pythium ultimum。他们造成多种农作物和蔬菜的根腐、幼苗和茎的腐烂。据统计，由该属病原菌引起的植物病害造成全世界每年十亿美元的损失。由腐霉引起的病害非常常见，特别是在作物的幼苗阶段^[4]。