摘 要

水稻稻曲病是由稻曲菌侵染水稻稻穗引起的真菌病害，现已成为世界稻谷主产区主要的真菌病害之一。水稻稻曲病主要在稻穗上发病，一般在水稻始花期至乳熟期病菌侵入初步形成的谷粒，形成稻曲球。稻曲菌侵染水稻形成的稻曲球一方面危害水稻的产量和质量，另一方面产生的毒素危害人畜健康。由于此病害在早期发生状况较轻，因此长期不被人们重视，导致稻曲病病情愈发严重，控制稻曲菌的发生势在必行。但是，目前市场上缺乏对水稻稻曲病的有效防控手段，因此研发稻曲病的抗病品种对农业生产上防控稻曲病具有重要意义。本研究拟通过构建稻曲菌效应子EA145的植物表达载体，研究效应子对植物免疫的调控，为农业生产上研发抗稻曲菌的作物品种奠定基础。

关键词：稻曲病；效应子；载体构建

Vector Construction and Functional Verification of Ustilaginoidea virens effector

ABSTRACT

Ustilaginoidea virens (Cooke) Takah is an ascomycetous fungus that causes rice false smut, a devastating emerging disease worldwide. Ustilaginoidea virens infected mainly in the rice ear, usually in the period of the initial flowering period of rice and the initial formation of the grain in the formation of the rice ball. The rice balls not only impact to the production and quality of rice, but also are harmful to the health of animals because of the toxin they produced. Because the disease occurs in early lighter condition, therefore is not taken seriously by people for a long period, thus this disease occurred increasingly severe, and it is imperative to control the occurrence of this disease. However, there are no effective measures to prevent and control this disease, thus cultivating new resistant rice cultivars is vital important for controlling rice false smut disease. In this project, we aim at study the function of Ustilaginoidea virens effector EA145 on plant by constructing the plant expression vector. The results will provide the foundation to the rice resistant cultivating.

Key words：Rice false smut；Effector；Rice diseases；Vector construction

目 录

1 文献综述 1

1.1水稻稻曲病概述 1

1.1.1稻曲病菌的生物学特性 1

1.1.2 水稻稻曲病发病症状及特点 2

1.1.3水稻稻曲病的危害 2

1.1.4病菌传播 2

1.2杀菌剂抗性研究 2

1.2.1抗药性检测 3

1.2.1.1传统抗药性检测 3

1.2.1.2抗药性分子检测 4

1.3效应因子 4

1.3.1效应子概述 4

1.3.2 效应子的功能以及作用机制 4

1.4本研究目的与意义 5

2 材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1 菌株 5

2.1.2主要试剂及试剂盒 6

2.2实验方法 6

2.2.1 pBIN-GFP4-EA145载体构建 6

2.2.1.1获取EA145 DNA片段 6

2.2.1.2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 7

2.2.1.3 PCR产物回收纯化 7

2.2.1.4质粒双酶切 8

2.2.1.5重组 8

2.2.2转化大肠杆菌 8

2.2.2.1大肠杆菌DH5α感受态制备 8

2.2.2.2大肠杆菌转化 9

2.2.2.3大肠杆菌菌落PCR 9

3 结果与分析 10

3.1 EA145基因PCR扩增 10

3.2 pBIN-GFP4载体酶切 10

3.3重组质粒转化大肠杆菌及菌落PCR阳性克隆验证 11

3.4总结 12

致 谢 12

参考文献 13

1 文献综述

水稻原产中国，我国有着深远的种植历史，七千年前中国长江流域就种植水稻。水稻可以分为籼稻和粳稻、早稻和中晚稻，糯稻和非糯稻。水稻的生育类型是指水稻分蘖终止期（拔节期）与稻穗开始分化时期之间不同起讫关系水稻开始穗分化与拔节的关系分为三种。水稻三大主要病害是：稻瘟病、白叶枯病、纹枯病。其它重要病害有稻曲病、恶苗病、霜霉病等。病害流行暴发的根本原因是：优质感病品种比重增大，病菌生理小种增多，耕作栽培制度变化等向着有利于病害发生和危害的方向发展。

1.1水稻稻曲病概述

水稻稻曲病是由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens ( Cooke) Tak)引起的水稻真菌病害。又称伪黑穗病、绿黑穗病、谷花病、青粉病，俗称“丰产果”。该病只发生于水稻穗部，为害部分谷粒。受害谷粒内形成菌丝块渐膨大，内外颖裂开，露出淡黄色块状物，即孢子座，后包于内外颖两侧，呈黑绿色，初外包一层薄膜，后破裂，散生墨绿色粉末，即病菌的厚垣孢子，有的两侧生黑色扁平菌核，风吹雨打易脱落。据调查发现，稻曲病主要发生于亚洲稻区，如中国、印度、缅甸等东南亚国家。在欧洲、美洲和非洲等地区也均有发生^[1-2]。水稻稻曲病在历史上而言，其危害程度其实并不十分严重。但近年来随着全球尤其我国的农业科技水平不断提高，高产优质的杂交水稻大面积不断推广，水稻稻曲病危害在各地开始变得愈发汹涌严重，其病种危害程度逐年提高^[3]。

1.1.1稻曲病菌的生物学特性

稻曲病的分离难度现阶段较大，目前一般是采用组织分离法、后垣孢子悬浮液法和菌核萌发法三个办法进行对病原菌的分离和培养，其中组织分离法是当下最为主要的分离方法。^[4]有研究表明，水稻稻曲病病原有2个不同的生活阶段，一为无性态，属无性孢子类绿核菌属绿核菌；一为有性态，属子囊菌亚门麦角菌属稻麦角菌。

1.1.2 水稻稻曲病发病症状及特点

水稻稻曲病主要在水稻稻穗上发病，一般在水稻始花期至乳熟期发生。病菌首先会侵入谷粒并逐渐生长露出淡黄色小型块状物，而后小型块状物逐渐长大并且撑开颖壳外露并包裹整个花器，最后逐渐开裂并有绿褐色丝绒装物生出整个病粒形成一个菌核结构^[5]。

1.1.3水稻稻曲病的危害

稻曲病不仅影响水稻的产量和品质，降低水稻的商品价值，病菌中更是含有对人畜有害的毒素。在1粒稻曲病稻粒上可附着着1.2亿个厚垣孢子，使用带有稻曲病菌的大米，对人类健康存在着潜在的威胁。王成钊等^[6]研究表明，水稻稻曲病粒数的增加与结实率呈极显著的负相关，与千粒重的下降均呈极显著的正相关。有研究表明，稻曲病主要影响水稻的结实率和千粒重^[7-8]。

1.1.4病菌传播

病菌以落入土中菌核或附于种子上的厚垣孢子越冬。翌年菌核萌发产生厚垣孢子，由厚垣孢子再生小孢子及子囊孢子进行初侵染。

1.2杀菌剂抗性研究

杀菌剂又称杀生剂、杀菌灭藻剂、杀微生物剂等，通常是指能有效地控制或杀死水系统中的微生物——细菌、真菌和藻类的化学制剂。使用杀菌剂防治植物病害是保证农作物高产、稳产的重要措施之一。近百年来，杀菌剂在植物病害控制中起了非常巨大的作用。但是有时会发现，过去有效的杀菌剂在作物中失去了控制病害的作用。有许多可能的原因，例如错误的喷雾。雨水冲刷等。但也有可能是引起病害的病原物对杀菌剂产生了抗性。杀菌剂的抗性归因于病原菌的变化，而不是杀菌剂的变化或寄主植物的变化。病原物从敏感到抗药的变化会遗传变异，这种遗传变异可在病原物连续后代中遗传。杀菌剂在20世纪70年代前使用的杀菌剂几乎都是传统的保护性杀菌剂，作用为点多，不易引发病原菌产生出抗药性。但是一旦病原物已经侵入植物，那么保护性杀菌剂就不能够发挥其作用，因为这种杀菌剂缺少进入寄主植物进而杀死病原物的能力。一直到六七十年代，随着高效、内吸、选择性强的杀菌剂被开发应用。杀菌剂抗性变得越来越严重和普遍，经常会导致植物病害化学防治失败，农业生产从而遭到巨大的损失。因此许多国家和地区相继开展了对杀菌剂的抗性研究。主要分为农业杀菌剂和工业杀菌剂两种。人类在保护劳动成果而与植物的病害进行的长期斗争中，学会制造和使用杀菌剂对植物病害进行灭杀与隔绝。然而因为杀菌剂的广泛推广使用，同时也加速了抗药性病原群体的不断形成与壮大，从而导致植物病害防止转向失败。恶苗病是以种传为主的病害^[9]。化学农药能有效的杀除附着在种子表面的病原菌或抑制其活动，控制传病，降低发病率，从而最大限度的控制再侵染过程，降低大田的产量损失率^[10]。但连续多年应用同一种药剂浸种或拌种防治水稻恶苗病，恶苗病菌就能形成抗性种群，并具有相当高的抗性强度^[11]。

1.2.1抗药性检测

在合理用药和及时调整抗药性的策略过程中，病原菌对杀菌剂的抗药性检测显得尤为的重要。抗药性检测可以通过传统抗药性检测方法和现代分子检测方法来实现。

1.2.1.1传统抗药性检测

需分离大量纯培养的菌株放在含有要药物的培养基上，此过程费时费力，有时很难把握监测过程，且监测精度不高。而对于基因组中控制抗性的突变位点不明确的病原菌或不具备抗药性分子检测条件的单位，这种传统的抗药性监测必不可少^[12]。

1.2.1.2抗药性分子检测

随着分子生物技术的发展，核酸水平的分子检测技术对已明确抗药性突变位点的病原菌可以快速灵敏地检测出田间早期出现的抗药性菌株和检测抗药性群体的发展动态。运用此种方法的前提是病原菌对杀菌剂的抗药性已明确是由点突变引起的。

1.3效应因子

1.3.1效应子概述

病原菌在侵染寄主的过程中会分泌大量的蛋白，影响植物细胞的功能和生理代谢，这类蛋白称为效应子。效应因子是一类病原菌分泌的蛋白质，根据其作用场所分为两类：作用于寄主质外体的质外体效应子和作用于植物细胞内的胞内效应子。效应子干扰记住细胞的生理和功能，调控其防卫反应^[14]。当寄主植物中含有与之对应的抗病蛋白时，效应因子会触发植物的防卫反应，此时的效应因子又被称为无毒蛋白。而当寄主植物中不含与之对应的抗病蛋白时，效应因子往往会表现出毒性功能，抑制植物的免疫反应，从而促进病原菌的侵染^[15]。

1.3.2 效应子的功能以及作用机制

自然界中，植物病原真菌、细菌、卵菌以及线虫在侵染寄主的过程中都能分泌大量的效应子调控植物的免疫反应。这些效应子在寄主细胞内能够结合细胞的不同组分，发挥不同功能。例如丁香假单胞的效应子HopM1定位在细胞的内颗粒体上，能够抑制植物的ETI和PTI。黑粉菌效应子Cmu1能够调控植物水杨酸含量调理植物免疫。致病疫霉的另一个效应子Avrblb2能够与寄主的木瓜类半胱氨酸蛋白酶C14互作并将其聚集到吸器周围，抑制C14的外泌，促进病原菌的侵染。同时，病原菌的效应子如果被植物相应的抗病蛋白识别，则能触发植物的免疫介导抗性，例如，寄生霜霉的无毒基因ATR1和ATR13可以引发RPP1和RPP13介导的拟南芥的抗病性，将这两个基因与丁香假单胞菌的效应子AvrRPS4的N端融合，利用细菌的三型分泌系统将这两个无毒基因输送到含有RPP1和RPP13抗性基因的拟南芥细胞中，结果成功的引发这两种抗性基因介导的细胞死亡，说明ATR1和ATR13和对应的抗病基因的互作发生在细胞质中。致病疫霉菌的Avr3a效应子能够触发植物含有Rps3a的马铃薯品种的抗性等。

1.4本研究目的与意义

稻曲病是水稻的头号病害,已给水稻造成了及其严重的危害。近年来随着肥料的大量施用,为稻曲病菌创造了良好的发育环境，治理稻曲病的难度又进一步增加。随着近几年农业科学研究的飞速发展，对效应子的研究也正如火如荼地展开，可以展望的是，效应子的研究将为研发抗病品种奠定基础。本次研究的目的在于检测稻曲病效应子EA145的表达载体，为其后期的转基因研究奠定基础。

2 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1 菌株

稻曲菌P1，pBIN-GFP4载体，大肠杆菌DH5α感受态。农杆菌GV3101感受态。

2.1.2主要试剂及试剂盒

PCR相关酶以及试剂，氨卞青霉素 (50 mg/ml)，卡那霉素(50 μg/ml)，内切酶KpnⅠ,Sma I、重组酶ExnaseⅡ、5 X ceⅡ buffer、质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，LB培养基等。

2.2实验方法

2.2.1 pBIN-GFP4-EA145载体构建

2.2.1.1获取EA145 DNA片段

以PVX-EA145质粒DNA为模板，以GFP4-EA145-F (5’-ATTTACGAACGAT AGGGTACCATGCAGGGCGGCGACGAC-3’)、GFP4-EA145-R(5’-GCCCTTGC TCACCATGGATCCATAGAGACGGGCGCTCAAGAA -3’) 为引物进行PCR扩增。