摘 要

本研究首次应用环介导等温核酸扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏高的冬生疫霉菌（Phytophthora hibernalis）的检测方法。以适合冬生疫霉菌分子检测的基因序列Ypt1作为研究标靶，设计了Phi6-LAMP特异性引物，建立反应体系与条件，并进行特异性、灵敏度、实际样本的检验。结果表明整个实验仅需80min即可用肉眼直接目测实验结果。在 64 ℃等温条件下进行核算扩增反应80min，反应后经2种方法验证扩增结果 ：(1). 在扩增前加入染料羟基萘酚蓝（HNB）作为反应指示剂，根据HNB的颜色变化来判定反应结果；(2). 2%琼脂糖凝胶电泳验证。在特异性检测中，仅有冬生疫霉菌株HNB显色观察到天蓝色阳性反应，同时扩增出梯型条带，而其他疫霉、腐霉、真菌供试菌株中均没有观察到这些现象。在灵敏度检测中，Phi6-LAMP技术最低检测限度为10pg / μL。该方法的建立为冬生疫霉菌的检疫和其所致病害的快速诊断提供了新的技术。

关键词： 冬生疫霉、LAMP、羟基萘酚蓝（HNB）

THE RESEARCH OF LOOP-MEDIATED ISOTHERAL AMPLICATION (LAMP) IN RAPID DETECTION OF PHYTOPHTHORA HIBERNALIS

ABSTRACT

This study applies on Loop - mediated isothermal amplification(LAMP), established a judgment based on color of simple, rapid and sensitive to Phytophthora hibernalis detection method. Based on Ypt1 which is used P. hibernalis as the target, designed the Phi6 - LAMP specific primers, reaction system and conditions, and the specificity, sensitivity, actual sample inspection. The results show that the whole experiment can be visually measured with the naked eye in only 80min.Accounting under the conditions of 64 ℃ isothermal amplification reaction 80 min, reaction after amplification result testified by two methods: (1) add dye before amplification HNB as the indicator reaction, according to the results to determine whether the color change of the HNB; (2). 2% agarose gel electrophoresis validation. In the specificity of detection, just P. hibernalis strains HNB color sky blue positive reaction was observed, amplify the ladder type stripe at the same time, while other phytophthora and pythium, fungal strains were not observed in these phenomena. In sensitivity detection, the minimum detection limit of phi6-lamp technology is 1ng/ μL. The establishment of this method provides a new technology for the quarantine of P. hibernalis and the rapid diagnosis of diseases caused by it.

Key Words: Phytophthora hibernalis; LAMP; HNB

目 录

1 引言 - 1 -

1.1检疫性冬生疫霉概述 - 1 -

1.2环介导等温扩增技术概述 - 1 -

1.2.1环介导等温扩增技术原理 - 2 -

1.2.2环介导等温扩增产物的鉴定方法 - 4 -

1.2.3环介导等温扩增技术的特点 - 4 -

2 材料与方法 - 5 -

2.1供试菌株与材料 - 5 -

2.2实验方法与技术路线 - 6 -

2.3基因组DNA提取 - 7 -

2.4 LAMP引物设计与合成 - 7 -

2.5 LAMP体系特异性评价实验 - 9 -

2.6 LAMP反应体系优化 - 9 -

2.7 LAMP反应体系灵敏度评价实验 - 10 -

2.8人工接种发病组织检测 - 10 -

3 结果与分析 - 11 -

3.1 LAMP引物可行性验证 - 11 -

3.2 LAMP反应特异性验证 - 13 -

3.3 LAMP反应最优体系 - 16 -

3.4 LAMP反应体系灵敏度验证 - 17 -

3.5人工接种发病组织的验证 - 18 -

总结与讨论 - 20 -

致 谢 - 22 -

参考文献 - 23 -

1. 引言

1.1检疫性冬生疫霉概述

疫霉是一类主要引起水果及其种苗病变的卵菌，在世界范围内已经报道的疫霉约有100种，我国约有27种，随着近几年我国水果及其种苗进口量上升，也大大增加了检疫性疫霉入侵的风险。丁香疫霉（Phytophthora syringae）、冬生疫霉（P. hibernalis）、栗疫霉黑水病菌（P. cambivora）、草莓疫霉红心病菌（P. fragariae）、树莓疫霉根腐病菌（P. fragariae）这5种疫霉为我国禁止入境的检疫性疫霉，其中冬生疫霉在澳大利亚西部的柑橘果实上首次被发现（Carne，1925），目前主要分布在以色列、土耳其、南非、法国、英国、西班牙、希腊、意大利、美国、葡萄牙、澳大利亚、新西兰、斐济、多巴哥、委内瑞拉（吴品珊等，2010），在我国尚未分布，其传播速度快、流行性广、毁灭性高，可导致植物大量减产，甚至绝产、死亡，一旦传入我国将对国内水果贸易及出口销售造成巨大障碍（张秋娥等，2012）。

冬生疫霉主要侵染柑橘属及苹果属植物，如脐橙、柠檬、苹果等，可引起果实褐腐；同时还可侵染如甜椒、番茄、玫瑰、杜鹃、贝壳杉等，造成寄主植物枯萎、根腐或溃疡（张海峰等，2008）。该病菌属于低温型有害病菌，发病最适温度为15，当低于5或高于25时病菌将停止生长。其卵孢子可在发病组织和土壤中越冬，第二年气温上升、雨量增加时开始活动，其孢子囊会释放游动孢子随雨水飞溅到近地面的果实上并从伤口侵入从而导致果实发病造成大量脱蒂落果（Luo J F et al，2012）。该种疫霉在寒冷高湿季节危害严重，在田间及贮运期间均能发病，发病果实腐烂后易引起与其他病菌如酸腐病菌和青霉菌的复合侵染（Adaskaveg J E et al，2015），大大增加了检疫及防治难度。